脂質アシルトランスフェラーゼを用いる食用油精製のためのプロセス

专利摘要:
ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）および脂質アシルトランスフェラーゼと混合する工程と、ｂ）約４５〜約９０℃で約１０分間〜１８０分間、前記混合物を撹拌する工程と、ｃ）油相とガム相を分離する工程とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムするプロセス。一実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくは、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせて用いられる。脂質アシルトランスフェラーゼを用いる脱ガム油のガム相を改変するためのプロセスもまた本明細書に教示される。
公开号:JP2011505865A
申请号:JP2010538882
申请日:2008-12-11
公开日:2011-03-03
发明作者:ヨルン；ボルク ソエ，；アン；ビクトリア ブラウン，
申请人:ダニスコ エイ／エス；
IPC主号:C12P7-64

专利说明:

[0001] （関連する出願への参照）
以下の関連する出願を参照する：ＵＳ２００２−０００９５１８、ＵＳ２００４−００９１５７４、国際公開第２００４／０６４５３７号、国際公開第２００４／０６４９８７号、国際公開第２００５／０６６３４７号、国際公開第２００５／０６６３５１号、２００６年２月２日に出願された米国特許出願第６０／７６４，４３０号、国際公開第２００６／００８５０８号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００５５８号および米国特許出願第１１／６７１，９５３号。これらの出願の各々およびこれらの出願の各々において引用された文献の各々（「出願引用文献」）、ならびに該出願引用文献において参照または引用された各文献は、これらの出願の文中または実行の間のいずれかにおける、ならびにそのような実行の間に進んだ特許性のサポートにおける議論は、参考により本明細書中に援用される。種々の文献がまた、本文中で引用される（「明細書引用文献」）。明細書引用文献のそれぞれ、および明細書引用文献中で引用または参照された各文献は、参考により本明細書中に援用される。]
[0002] 本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを用いる食用油（好ましくは、植物油）精製プロセスに関する。本発明はさらに、脂質アシルトランスフェラーゼを用いる、食用油（好ましくは、粗製食用油）（例えば、植物油）および／または食用油（好ましくは、植物油）のガム相を処理するプロセスに関する。]
背景技術

[0003] 脂質アシルトランスフェラーゼは、食品用途において有利であることは公知である。脂質アシルトランスフェラーゼは、食材中にかなりのアシルトランスフェラーゼ活性を有することが見出されている。この活性は、食材を調製する方法において驚くべき有益な適用をもつ。]
[0004] 例えば、特許文献１は、脂質アシルトランスフェラーゼの使用による乳化剤のインサイチュー生成のための方法およびそれに関連する利点を開示する。]
[0005] 国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００１／０００５５８号は、（異種性）宿主細胞における脂質アシルトランスフェラーゼの発現を教示し、参照により本明細書に組み入れられている。]
[0006] 食用油精製の目的は、質（例えば、味、香り、および外観）および貯蔵性に影響する望ましくない不純物を除去することである。]
[0007] 遊離脂肪酸、金属イオン、有色化合物、臭気、ガムなど、幅広い種類のこれらの不純物のために、一連の化学的および物理的プロセスが、通常、精製のために用いられる（例えば、非特許文献１参照）。]
[0008] 伝統的には、物理的脱ガムプロセスおよび化学的脱ガムプロセスである２つのプロセスが、油の脱ガムのために用いられている。]
[0009] いわゆる化学的精製において、ほとんど全ての遊離脂肪酸含有量が、大過剰量のＮａＯＨでの最初の処理によって除去される。また、リン脂質含有量は、典型的には１０ｐｐｍ未満のリンレベルまで減少する。油は続いて、脱色および脱臭される。]
[0010] いわゆる物理的精製は、一般的に、水脱ガム段階、続いて、酸脱ガム、中和、脱色、遊離脂肪酸を除去するための水蒸気蒸留、および脱臭からなる。]
[0011] 物理的精製中に酸脱ガムを用いる代わりに、酵素的脱ガムを用いるように発展した。]
[0012] 酵素的脱ガムプロセスは、膵臓ホスホリパーゼの使用に基づいて開発された。この酵素はユダヤ教の掟にかなっていなかったため、ホスホリパーゼは、結局、微生物のホスホリパーゼＡ１（Ｌｅｃｉｔａｓｅ ＵｌｔｒａＴＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）（非特許文献２）によって置き換えられた。]
[0013] 酵素的プロセスは、費用節約、より高い収率、およびより環境に優しいプロセスを含む、化学的または物理的脱ガムプロセスに対していくつかの優位性を有する。]
[0014] 酵素的油脱ガムプロセスは、既に水脱ガムされた油へのホスホリパーゼの添加に基づいた。]
[0015] 特許文献２において、食用油の酵素的脱ガム用に、脂質アシルトランスフェラーゼが教示された。特許文献２は、水脱ガムされた油への脂質アシルトランスフェラーゼの添加、または油が水脱ガムプロセスを受ける必要のない、粗製油への脂質アシルトランスフェラーゼの添加を教示する。]
[0016] 「水脱ガムされた油」は、典型的には、１〜２％ｗ／ｗの熱い軟水を温かい（７０〜９０℃）粗製油と混合することを含む通常の「水脱ガムプロセス」によって獲得することができる（ＡＯＣＳ脂肪および油の処理入門（ＡＯＣＳ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｆａｔｓ ａｎｄ Ｏｉｌｓ）、表８、脱ガムプロセス（Ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｏｃｓ．ｏｒｇ／ｍｅｅｔｉｎｇｓ／ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ｍｏｄ３ｓａｍｐｌｅ．ｐｄｆ）。粗製油に加えられる水の量が、典型的には、粗製油中のリン脂質の量とほぼ等しいことは経験則である。通常の処理時間は、３０〜６０分間である。水脱ガム段階は、水和した場合、油中で不溶性になるホスファチドおよび粘着性ガムを除去する。水和ホスファチドおよび水和ガムは、沈殿、濾過、または遠心分離によって油から分離することができ、遠心分離の実施がより普及している。前記の水脱ガムプロセスにおける本質的な目的は、水和ホスファチドを油から分離することである。上記の熱水の油への混合は、当技術分野における標準的な水脱ガム手順に従う水溶液の油への混合として、本明細書では広く理解されるべきである。]
[0017] 通常の水脱ガムプロセスにおいて、ホスファチドの主要部分は、重いガム相において除去される。水脱ガムプロセスの終わりに、油相はガム相から分離される。ガム相はさらに商品へと加工することができるが、それは、本質的に油精製の副産物としてみなされる。商業的に重要であるのは、油相である。しかしながら、ホスファチドは、良い乳化剤であり得るため、水脱ガム中のガム相において、いくらかの油が必然的に失われる。これは、水脱ガム後の油相における油の収率の低下をもたらす。]
[0018] 油価格の高騰およびバイオディーゼルのための植物油の必要性の増大で、高い油収率のために食用油の処理を最適化することが重要である。]
[0019] 国際公開第２００４／０６４５３７号
国際公開第２００６／００８５０８号]
先行技術

[0020] Ｂａｉｌｅｙ’ｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｉｌ ａｎｄ Ｆａｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、２００６年、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、第６版
Ｏｉｌ Ｍｉｌｌ Ｇａｚｅｔｔｅｅｒ、１１１巻、２００５年７月、２〜４頁]
課題を解決するための手段

[0021] 本発明の態様は、特許請求の範囲および以下の解説に提示されている。]
[0022] 驚くべきことに、水脱ガムプロセスを実行する間または前に、１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼを粗製食用油に加えることによって、油相中の油の収率を有意に増加させ得ることが見出された。換言すれば、油のガム相への損失を有意に低下させることができる。]
[0023] 加えて、驚くべきことに、水脱ガムプロセスを実行する間または前に、１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼを粗製食用油に加えることによって、得られたガム相がはるかに粘性が低いことが見出された。これは、より有利な遠心分離パラメーターを可能にすることができる。]
[0024] 驚くべきことに、水脱ガムプロセスを実行する間または前に、１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼを粗製食用油に加えることによって、このプロセスから得られたガム相は、インキュベートまたは貯蔵することができ、ガム相中のリン脂質の（残存する活性脂質アシルトランスフェラーゼによる）さらなる加水分解を観察し得ることもまた見出された。その後、本発明者らは、ガム相において遊離脂肪酸（酸性油）および残存するトリグリセリドを含む油性相を単離することが可能であることを見出している。この酸性油は、食事に加えられる通常のガム相より高い価格で販売することができる。加えて、驚くべきことに、（酸性油の分離後の）残っている固相は、通常のガムよりリンレベルが高く、したがって、有機リンの供給源として用いることができることを見出している。]
[0025] 驚くべきことに、１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼおよび１つまたは複数のホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の酵素の組合せが、食用油（例えば、植物油）の脱ガムに用いられた場合、相乗効果を生じることもまた見出している。]
図面の簡単な説明

[0026] Ａｓｎ８０Ａｓｐの変異（特に、アミノ酸８０は成熟配列中にある）を有する変異体Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す図である。
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ＃７９６５）由来の脂質アシルトランスフェラーゼアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
データベースバージョン６からのｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号２）を示す図である。
生物Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から獲得したアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
生物Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（ＡＡＧ０９８４０４；ＧＩ：９９６４０１７）から獲得したアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿６３１５５８）から獲得したアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。
生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＣＡＣ４２１４０）から獲得したアミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。
生物Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号Ｐ４１７３４）から獲得したアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。
生物Ｒａｌｓｔｏｎｉａ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＬ６４６０５２）から獲得したアミノ酸配列（配列番号８）を示す図である。
配列番号９を示す図である。仮説上のタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］を保存するＳｃｏｅ１ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８。
配列番号１０として表されるアミノ酸を示す図である。仮説上のタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］を保存するＳｃｏｅ２ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＣ０１４７７．１ ＧＩ：９７１６１３９。
アミノ酸配列（配列番号１１）Ｓｃｏｅ３ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６推定上の分泌タンパク質を示す図である。［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］
アミノ酸配列（配列番号１２）Ｓｃｏｅ４ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１ 推定上の分泌タンパク質を示す図である。［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］
アミノ酸配列（配列番号１３）Ｓｃｏｅ５ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３ 推定上のリポタンパク質を示す図である。［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］
アミノ酸配列（配列番号１４）Ｓｒｉｍ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８。ＧＤＳＬ−リパーゼを示す図である。［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ］
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ亜種Ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。
配列番号１９を示す図である。仮説上のタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］を保存するＳｃｏｅ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８。
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異誘発のために使用される融合構築物のアミノ酸配列（配列番号２５）を示す図である。下線付きのアミノ酸はキシラナーゼシグナルペプチドである。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列（配列番号２６）を示す図である。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列（配列番号２７）を示す図である。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列（配列番号２８）を示す図である。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素ＧＤＳｘ ３００アミノ酸のポリペプチド（配列番号２９）を示す図である。
Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素ＧＤＳｘ ２８４アミノ酸のポリペプチド（配列番号３０）を示す図である。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素ＧＤＳｘ ２６９ａａのポリペプチド（配列番号３１）を示す図である。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素＼ＧＤＳｘ ２６９アミノ酸のポリペプチド（配列番号３２）を示す図である。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド（配列番号３３）を示す図である。
生物Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から獲得したアミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である（特に、これは成熟配列である）。
変異体Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列（配列番号３５）を示す図である（特に、これは成熟配列である）。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｉ由来のヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す図である。
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｉ由来のアミノ酸配列（配列番号３７）を示す図である。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ／ＧＤＳｘ ５４８アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号３８）を示す図である。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ由来のヌクレオチド配列（配列番号３９）を示す図である。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ／ＧＤＳｘ由来のアミノ酸配列（配列番号４０）を示す図である。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ／ＧＤＳｘ ３００アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号４１）を示す図である。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ由来のヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す図である。
Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ／ＧＤＳｘ ２６８アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号４３）を示す図である。
Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す図である。
Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来のアミノ酸配列（配列番号４５）を示す図である。
Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来のヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す図である。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ／ＧＤＳｘ由来のアミノ酸配列（配列番号４７）を示す図である。
Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ／ＧＤＳｘ由来のヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す図である。
ＧＤＳｘモチーフ（Ｌ１３１およびＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓおよびＴ．ｆｕｓｃａにおいてＧＤＳＹ）、ＧＡＮＤＹボックス（ＧＧＮＤＡまたはＧＧＮＤＬのいずれかである）およびＨＰＴブロック（保存された触媒ヒスチジンと考えられる）の保存を表す、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓおよびＴ．ｆｕｓｃａ由来のＬ１３１および相同体のアラインメントを示す図である。これら３種の保存されたブロックを強調する。
Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号１７を示す図である。
Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号１８を示す図である。
活性部位にグリセロールを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造のリボン表示を示す図である。図はＤｅｅｐ Ｖｉｅｗ Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒを使用して作成された。
１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造を示す図である。Ｄｅｅｐ Ｖｉｅｗ Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒを使用した側面図、活性部位にグリセロールを有する、活性部位グリセロールの１０Å内の残基を黒色にする。
１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造を示す図である。Ｄｅｅｐ Ｖｉｅｗ Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒを使用した上面図、活性部位にグリセロールを有する、活性部位グリセロールの１０Å内の残基を黒色にする。
アラインメント１を示す図である。
アラインメント２を示す図である。
Ｐ１０４８０（Ｐ１０４８０はＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ酵素についてのデータベース配列である）に対する１ＩＶＮのアラインメントを示す図であり、このアラインメントはＰＦＡＭデータベースから獲得して、モデル構築プロセスにおいて使用された。
Ｐ１０４８０（Ｐ１０４８はＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ酵素についてのデータベース配列である）に対する１ＩＶＮのアラインメントを示す図であり、このアラインメントはＰＦＡＭデータベースから獲得して、モデル構築プロセスで使用された。
Ｐ１０４８０がＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａについてのデータベース配列であるアラインメントを示す図である。この配列をモデル構築および部位選択のために使用する。全長タンパク質（配列番号２５）が示され、成熟タンパク質（配列番号３４と同じ）は残基１９から始まることを記す。Ａ．ｓａｌはＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（配列番号４）ＧＤＳＸリパーゼであり、Ａ．ｈｙｄはＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（配列番号３４）ＧＤＳＸリパーゼである。コンセンサス配列は、列挙した配列間で異なっている位置に＊を含む。
実施例１において使用した遺伝子構築物を示す図である。
実施例１において使用したコドン最適化遺伝子構築物（ｎｏ．０５２９０７）を示す図である。
ＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子を含有するＸｈｏＩ挿入物の配列を示す図であり、−３５および−１０ボックスに下線をつける。
１％トリブチリンアガー上、３７℃で４８時間増殖後のＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０（配列番号１６を含む−上のコロニー）およびＢＭＬ７８０（ホスト株のみ−下のコロニー）を示す図である。
シグナル配列（プレＬＡＴ−位置１〜８７）を含むＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ由来のヌクレオチド配列（配列番号４９）を示す図である。
生物Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａから獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す図である。
生物Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａから獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す図である。
生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００３８８８．１：８３２７４８０．．８３２８３６７）から獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す図である。
生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＬ９３９１３１．１：２６５５４８０．．２６６３６７）から獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５３）を示す図である。
生物Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号Ｚ７５０３４）から獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す図である。
生物Ｒａｌｓｔｏｎｉａから獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５５）を示す図である。
仮説上のタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］を保存するＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ３９７０７．１ ＧＩ：４５３９１７８をコードする配列番号５６として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
仮説上のタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］を保存するＳｃｏｅ２ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＣ０１４７７．１ ＧＩ：９７１６１３９をコードする配列番号５７として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
Ｓｃｏｅ３ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ８８８３３．１ ＧＩ：７６３５９９６推定上の分泌タンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］をコードする配列番号５８として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
Ｓｃｏｅ４ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ８９４５０．１ ＧＩ：７６７２２６１推定上の分泌タンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］をコードする配列番号５９として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
Ｓｃｏｅ５ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ６２７２４．１ ＧＩ：６５６２７９３推定上のリポタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）］をコードする配列番号６０として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
Ｓｒｉｍ１ ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＡＡＫ８４０２８．１ ＧＩ：１５０８２０８８ ＧＤＳＬ−リパーゼ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ］をコードする配列番号６１として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ＃７９６５）由来の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号６２）を示す図である。
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ亜種、Ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号６３）を示す図である。
キシラナーゼシグナルペプチドを含有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ由来の酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す図である。
本明細書において配列番号１６としておよび翻訳後修飾を受けた後は配列番号６８として示すＡｓｎ８０Ａｓｐの変異（特にアミノ酸８０は成熟配列中にある）を有する変異体Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列（配列番号６８のアミノ酸残基２３５および２３６は翻訳後修飾の後に共有結合していない）を示す図である。形成された２つのペプチドは、１つまたは複数のＳ−Ｓ架橋によって保持される。配列番号６８中のアミノ酸２３６は本明細書において示す配列番号１６中のアミノ酸残基番号２７４に相当する。
粗製食用油を水脱ガム／精製するための従来プロセスを示す図である。水脱ガムの最後に油相およびガム相が分離される。この後に油相およびガム相は従来の／公知の方法によってさらに加工され得る。
酵素で粗製食用油を水脱ガム／精製するための本発明によるプロセスを示す図である。油相とガム相とが分離される際に獲得される油相は、比較するプロセス（すなわち図７４ａに示すプロセス、すなわち酵素を加えない水脱ガム）の油相と比較してより高い収率を有する。油相および／またはガム相は、任意選択でさらなる従来の加工法などでさらに加工され得る。
本発明による実験室規模の水脱ガムプロセスの工程系統図である。
水脱ガムに続くガム相および油相の分析についての図解である（すなわち、図７４ａまたはｂのステップ１）。
本発明に従った粗製ダイズ油の水脱ガム後３時間でのガム相を示すグラフである。
粗製ダイズ油の酵素を使うおよび使わない水脱ガム後３０分間でのガム％を示すグラフである。
粗製ダイズ油の水脱ガム後のガムの量についての水の量（１．５、２または２．５％）の効果を示すグラフである。
酵素を使うおよび使わない粗製ダイズ油の水脱ガム後ガムの量についての、様々な量の水（１．５、２または２．５％）での脱ガムでの酵素を使うおよび使わない効果を示すグラフである。
異なる投与量の酵素での粗製ダイズ油の水脱ガム後の油相中のリンのｐｐｍを示すグラフである。カラム１は酵素を使わない対照である。
異なる投与量の酵素での粗製ダイズ油の水脱ガム後のガム相中のトリグリセリド％を示すグラフである。カラム１は酵素を使わない対照である。
異なる投与量の酵素での粗製ダイズ油の水脱ガム後のガム相中の相対的ＰＡ％を示すグラフである。カラム１は酵素を使わない対照である。
異なる投与量の酵素での粗製ダイズ油の水脱ガム後のガム相中の相対的ＰＥ％を示すグラフである。カラム１は酵素を使わない対照である。
対照と比較して酵素的脱ガムにおいて獲得された油の収率（％）の増加を示すグラフである。油は３分間様々な相対遠心力で遠心分離される。
異なる時間（棒の中に示す分）で遠心分離された油から獲得されたガムの含有量（％）およびガム中のトリグリセリドの量を示すグラフであり、異なる相対遠心力が示されている。バッチ３：対照 ５５℃、４：酵素（ＫＬＭ３’）使用 ５５℃。
ずり速度の関数としての粘性を示すグラフである。測定値はバッチ１：対照 ７０℃およびバッチ２：酵素使用７０℃からのガムによる。
ガムの量（酵素的試料）を減算したガムの量（対照）から算出した油の収率（％）を示すグラフである。
ガム相のＴＬＣ分析からの結果を示すグラフである。ＮａＯＨの量を漸増させた（０、０．１、０．２、０．５、１、１．５および１．９ｍｌ ４％溶液）脱ガムから獲得されたガム中のトリグリセリド含有量（％）。
ＧＣ結果を示すグラフである。ＮａＯＨのｍｌ数を増加させて脱ガムした、油中のＦＦＡ、フィトステロールおよびフィトステロールエステルの含有量（％）、試料１：対照（酵素およびＮａＯＨを使わない）；試料２〜８：ＫＬＭ３’（０．１ＴＩＰＵ−ｋ／ｇ）および漸増する量のＮａＯＨ（０、０．１、０．２、０．５、１、１．５および１．９ｍｌ ４％溶液）での酵素的試料。
ガム相のＴＬＣ分析からの結果を示すグラフである。ガム中のリン脂質（ＰＡ、ＰＥ、ＰＣおよびＰＩ）の相対的分解。試料１：対照（酵素およびＮａＯＨを使わない）；試料２〜７：ＫＬＭ３’（０．１ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ）および漸増するｍｌ数のＮａＯＨでの酵素的試料。
従来の水脱ガムおよび本発明による酵素的水脱ガム由来のガムの顕微鏡分析を示す図である（写真は、拡大率２００および４００倍、２５℃）。
従来法および酵素的脱ガム由来のガム相についてのＸ線分析を示すグラフである。
沈降漏斗（３日目）を示す図である。左：対照、右：酵素処理油
従来および酵素的水脱ガム由来のガムについての顕微鏡分析を示す図である。
対照と比較して酵素的脱ガムにおいて獲得された油の収率の増加を示すグラフである。
１、１．５および２％水で実施した対照および（本発明による）酵素的水脱ガム試料における油の損失を示すグラフである。油損失の算出：（％ガム／ガム中の％トリグリセリド）×１００％
対照（酵素を含まない）と比較した酵素的（ＫＬＭ３’）ガム試料中のホスファチジン酸およびホスファチジルエタノールアミンの相対的分解を示すグラフである。
様々な量の水（１．２５、１．５、１．７５および２％）での脱ガムから獲得された、酵素的ガム相の粘性測定を示すグラフである。
実施例９の表１に示す、ＫＬＭ３’を使い、かつ受容体の添加を伴う粗製ダイズの水脱ガム由来のガム相を示すグラフである。
ＨＰＴＬＣで分析したガム相におけるリン脂質の相対量を示すグラフである。
粗製ダイズ油の水脱ガム由来の油中のリンのＩＣＰ分析を示すグラフである（実施例９の表１）。
実施例１３、試料１〜９の３０分間インキュベーション後のＴＬＣ（ランニング緩衝液１）を示す図である。
実施例１３、試料１〜９の２４０分間インキュベーション後のＴＬＣ（ランニング緩衝液１）を示す図である。
実施例１３、試料１〜９の３０分間インキュベーション後のＴＬＣ（ランニング緩衝液６）を示す図である。ＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミン、ＰＡ＝ホスファチジン酸、ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール、およびＰＣ＝ホスファチジルコリン
実施例１３、試料１〜９の２４０分間インキュベーション後のＴＬＣ（ランニング緩衝液６）を示す図である。ＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミン、ＰＡ＝ホスファチジン酸、ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール、およびＰＣ＝ホスファチジルコリン
実施例１３、粗製油の脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）およびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）での酵素処理によるリン脂質の相対的分解を示すグラフである。反応時間２４０分間。
実施例１３、リン脂質ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ反応を示す図である。
実施例１３、粗製ダイズ油の脱ガムにおけるジグリセリド（ＤＡＧ）レベルについてのホスホリパーゼＣとＫＬＭ３’との相互作用を示すグラフである。
実施例１３、ＴＬＣ分析を示す図である。
トリグリセリドについての酵素添加の効果を示すグラフである。
トリグリセリドについての反応時間の効果を示すグラフである。
実施例１３に詳述するアシルトランスフェラーゼと３０および９０分間インキュベートしたジグリセリド／ＰＣ基質のＴＬＣ分析を示す図である。
実施例１３に詳述するアシルトランスフェラーゼと３０および９０分間インキュベートしたジグリセリド／ＰＣ基質のＴＬＣ分析を示す図である。
ジグリセリド／ＰＣ ８０／２０の基質中でのトリグリセリド形成についてのアシルトランスフェラーゼ酵素の効果を示すグラフである。
ジグリセリド／ＰＣ ８０／２０の基質中でのトリグリセリド形成についてのインキュベーション時間の効果を示すグラフである。
酵素的水脱ガムについての工程系統図を示す図である。
実施例１５に詳述する５５℃での水脱ガムおよび０ｄ、１ｄまたは７ｄのインキュベーションに続くガム相試料のＴＬＣ分析を示す図である。
実施例１５に詳述する４５℃での水脱ガムおよび０ｄ、１ｄまたは７ｄのインキュベーションに続くガム相試料のＴＬＣ分析を示す図である。] 図７４ａ
[0027] 本発明の詳細な態様
本発明の第１の態様によれば、ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）および脂質アシルトランスフェラーゼと混合する段階と、ｂ）約４５℃〜約９０℃で約１０分間〜１８０分間、前記混合物を撹拌する段階と、ｃ）油相とガム相を分離する段階とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムするプロセスが提供される。]
[0028] 本発明の第２の態様によれば、水脱ガムプロセスの完了後に油相中の油の収率を増加させるための食用油の水脱ガムの間（好ましくは、粗製食用油の水脱ガムの間）の脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供される。]
[0029] 本発明の第３の態様によれば、水脱ガムプロセスの完了後にガム相の粘性を減少させるための食用油の水脱ガムの間（好ましくは、粗製食用油の水脱ガムの間）の脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供される。]
[0030] 収率の増加および／または粘性の減少は、脂質アシルトランスフェラーゼの使用なしで脱ガムされた（水脱ガムされたか、または酵素的に水脱ガムされたかのいずれか）比較可能な油の油相および／またはガム相と比較した場合である。]
[0031] 第４の態様によれば、ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）および脂質アシルトランスフェラーゼと混合する段階と、ｂ）約４５℃〜約９０℃で約１０分間〜１８０分間、前記混合物を撹拌する段階と、ｃ）油相とガム相を分離する段階と、ｄ）最低約２時間と最高７日間の間（適切には、約１〜２日間まで）、活性脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を含むガム相をインキュベートする段階と、ｅ）ガム相から油を（例えば、遠心分離によって）分離する段階とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムするプロセスを本発明は提供する。]
[0032] 本発明はさらに、（好ましくは、食用油の脱ガム、例えば水脱ガムもしくは酵素的脱ガムまたはそれらの組合せから獲得可能である、または獲得された）ガム相を処理し（ガム相を、最低約２時間と最高７日間の間（適切には、約１〜２日間まで）、（単独の、または１つもしくは複数のホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた）１つまたは複数の（活性）脂質アシルトランスフェラーゼ酵素とインキュベートする）、ガム相から油を（例えば、遠心分離によって）分離する方法を提供する。]
[0033] 本発明はなおさらに、油の収率を増加させるための、および／または通常のガムよりリンレベルが向上している（酸性油の分離後の）固相を生成するための、（食用油を水脱ガムすること、酵素的脱ガムすること、またはそれらの組合せなどの脱ガムすることから獲得可能な、または獲得された）ガム相のインキュベーションにおける（単独の、またはホスホリパーゼＣと組み合わせた）脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。]
[0034] 酸性油が脂肪酸製造のために用いることができるため、（１つまたは複数の）酵素の使用は、ガムと比較して、酸性油の価値を増加させる。脂肪酸は、別なふうに食事に加えられるガムより高い価値を有する。]
[0035] 向上および／または増加は、（単独の、またはホスホリパーゼＣと組み合わせた）脂質アシルトランスフェラーゼによって処理されていないガム相と比較した場合である。]
[0036] 適切には、ガム相中の１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、食用油の酵素的脱ガム後にガム相に移行した可能性がある残存活性酵素を有してもよい。あるいは、ガム相中の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、加えられた脂質アシルトランスフェラーゼ（その酵素は、ガム相のインキュベーションの始めに、または間に加えてもよい）であってもよい。]
[0037] 特に、第４の態様におけるプロセス（およびガム相の他の処理）の終わりにおける油は、「酸性油」である。この酸性油は、食事に加えられる通常のガム相より高い価格で販売することができる。（酸性油の分離後の）残っているガム相は、固相と呼ばれることがある。驚くべきことに、（酸性油の分離後の）残っている固相は、通常のガムより高いリンレベルを有することが見出されており、したがって、有機リンの供給源として用いることができる。]
[0038] 適切には、ガム相は、約３０〜約７０℃、好ましくは約４０〜約６０℃、好ましくは約４０〜約５０℃、好ましくは約４０〜約４５℃で（単独の、または１つもしくは複数のホスホリパーゼＣ酵素とのいずれかの）脂質アシルトランスフェラーゼとインキュベートすることができる。]
[0039] 好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼでの粗製油の酵素的水脱ガムから獲得されたガム相は、約３０〜約７０℃、好ましくは約４０〜約６０℃、好ましくは約４０〜約５０℃、好ましくは約４０〜約４５℃でインキュベートすることができる。]
[0040] 適切には、脂質アシルトランスフェラーゼは、酵素命名法分類で分類されたものである（Ｅ．Ｃ．２．３．１．４３）。]
[0041] 一実施形態において、好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、ホスホリパーゼＣ（Ｅ．Ｃ．３．１．４．３）と組み合わせて用いられる。]
[0042] 一つの好ましい実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．４３）は、ホスホリパーゼＣ（Ｅ．Ｃ．３．１．４．３）と組み合わせて用いられる。]
[0043] したがって、本発明の一態様によれば、ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）ならびに脂質アシルトランスフェラーゼおよびホスホリパーゼＣの組合せと混合する段階と、ｂ）約４５℃〜約９０℃で約１０分間〜１８０分間、前記混合物を撹拌する段階と、ｃ）油相とガム相を分離する段階とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムするプロセスが提供される。]
[0044] 理論に縛られるつもりはないが、驚くべきことに、脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドを生成するための受容体分子として（ホスホリパーゼＣの反応によって生成した）ジグリセリドを用い得ることが見出されている。したがって、脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、これらの酵素間の相互作用が、いずれかの酵素のみを含む比較可能な油または酵素を含まない比較可能な油と比較して、両方の酵素を含む油においてトリグリセリド量の相乗的な増加を生じる。有利には、脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、これらの酵素間の相互作用は、いずれかの酵素のみを含む比較可能な油または酵素を含まない比較可能な油と比較して、両方の酵素を含む油においてジグリセリド量の相乗的な減少を生じる。脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、これらの酵素間の相互作用は、いずれかの酵素のみを含む比較可能な油または酵素を含まない比較可能な油と比較して、両方の酵素を含む油において油収率の相乗的な増加を生じる。]
[0045] ジグリセリドが油の「発煙点」にマイナスの影響を及ぼし得、および／またはより飽和した脂肪供給源の結晶化性質にマイナスの影響を及ぼし得るという理由のため、（ホスホリパーゼＣが単独で用いられた場合に起こり得る）油におけるジグリセリドの蓄積が、油にとって有害であり得るので、これらの酵素の組合せの使用は、ホスホリパーゼＣ単独の使用に対して有意な優位性を有する。]
[0046] したがって、本発明において、脂質アシルトランスフェラーゼの使用（特に、ホスホリパーゼＣと組み合わせた場合）のもう一つの利点は、脂質アシルトランスフェラーゼなしでの比較可能な油と比較して、および／または特に、ホスホリパーゼＣ単独で処理された比較可能な油と比較して、油におけるジグリセリド量を低下させ得ることである。]
[0047] 本発明の別の態様において、水脱ガムプロセスの完了後に油相において、油の収率を増加させるための、および／またはトリグリセリドレベルを増加させるための、ならびに／または水脱ガムプロセスの完了後に油相においてジグリセリドレベルを低下させるための、食用油の水脱ガムの間（好ましくは、粗製食用油の水脱ガムの間）のホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供される。]
[0048] 本発明のさらに別の態様によれば、水脱ガムプロセスの完了後にガム相の粘性を減少させるための、食用油の水脱ガムの間（好ましくは、粗製食用油の水脱ガムの間）のホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供される。]
[0049] これらの増加および／または低下は、ホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼで処理されていない比較可能な脱ガムされた食用油と比較した場合である。]
[0050] 一般的に、本明細書で論じられた増加および／または低下は、（単独かまたはホスホリパーゼＣと組み合わせてのいずれかの）脂質アシルトランスフェラーゼで処理されていない比較可能なプロセスまたは比較可能な油と比較する場合である。]
[0051] 別の態様によれば、本発明は、ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）およびホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼと混合する段階と、ｂ）約４５℃〜約９０℃で約１０分間〜１８０分間、前記混合物を撹拌する段階と、ｃ）油相とガム相を分離する段階と、ｄ）最低約２時間と最高７日間の間（適切には、約１〜２日間まで）、活性脂質アシルトランスフェラーゼを含むガム相をインキュベートする段階と、ｅ）ガム相から油を（例えば、遠心分離によって）分離する段階とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムするプロセスを提供する。]
[0052] リン脂質分解酵素（好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ）がホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、ホスホリパーゼＣを加えるのは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の添加の前でも、添加と同時でも、添加の後でもよい。]
[0053] 一実施形態において、好ましくは、ホスホリパーゼＣは、脂質アシルトランスフェラーゼの前に加えられる。]
[0054] 驚くべきことに、脂質アシルトランスフェラーゼおよびホスホリパーゼＣの組合せを用いることは、水脱ガムプロセスの完了後、油相において油の収率を有意に増加させることが見出されている。]
[0055] 理論に縛られるつもりはないが、ホスホリパーゼＣは、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン）をジグリセリド（例えば、１，２−ジアシルグリセロール）およびリン酸部分（例えば、コリンリン酸）へ加水分解し、その後、脂質アシルトランスフェラーゼが、ホスホリパーゼＣによって形成されたジグリセリド上へ脂肪酸を転移する−したがって、より多くのトリグリセリドを形成し、油収率を増加させることが想定される。この効果は、油収率への相乗的な（すなわち、好ましくは相加的より多い）増加をもたらす。]
[0056] 一実施形態において、適切には、本発明による食用油を脱ガムする方法および／または使用は、約４５〜９０℃、好ましくは約４５〜約７０℃で行い得る。]
[0057] 別の実施形態において、適切には、本発明による食用油プロセスを脱ガムする方法および／または使用は、約４４℃より高く、より好ましくは約４５℃より高く、より好ましくは約５０℃より高くで行い得る。]
[0058] 別の実施形態において、適切には、本発明によるプロセスおよび／または使用は、約６０℃未満、好ましくは約６５℃未満、好ましくは約７０℃未満で行い得る。]
[0059] 一実施形態において、適切には、本発明によるプロセスおよび／または使用は、摂氏約４５〜７０℃、好ましくは約４５〜６８℃、より好ましくは約５０〜６５℃で行い得る。]
[0060] 適切には、油および／または水の温度は、酵素が混合される場合の望ましい反応温度であり得る。]
[0061] 油および／または水は、酵素添加の前および／または添加中に、望ましい温度まで加熱および／または冷却してもよい。したがって、一実施形態において、本発明によるプロセスのさらなる段階は、油および／または水の冷却および／または加熱であり得ることが構想される。]
[0062] 好ましくは、本発明によるプロセスについての水含有量は、約０．１〜４％ｗ／ｗ、より好ましくは約０．１〜３％ｗ／ｗ、より好ましくは約０．５〜３％ｗ／ｗであり得る。]
[0063] 一実施形態において、本発明によるプロセスについての水含有量は、約１〜３％ｗ／ｗであり得る。]
[0064] 一実施形態において、本発明によるプロセスについての水含有量は、約３％ｗ／ｗ未満、適切には約２％未満であり得る。]
[0065] 一実施形態において、プロセスについての水含有量は、１％未満であってもよい。水の量を約１％未満まで低下させることは、結果として、水脱ガムプロセスにおいて有意な財政的な有利性を生じることができる。したがって、水の量を約１％未満まで低下させ得ることは、有意な費用削減をもたらすことができる。]
[0066] 適切には、反応時間（すなわち、混合物を撹拌する時間）は、約１０分間〜約１８０分間、好ましくは約１５分間〜約１８０分間、より好ましくは約１５分間〜６０分間、さらにより好ましくは約１５分間〜約３５分間であり得る。]
[0067] 一実施形態において、適切には、反応時間は、約３０分間〜約１８０分間、好ましくは約３０分間〜約６０分間であり得る。]
[0068] 一実施形態において、プロセスは、好ましくは、約ｐＨ４．５より高くで、約ｐＨ５より高くで、または約ｐＨ６より高くで行われる。]
[0069] 好ましくは、プロセスは、約ｐＨ４．６〜約ｐＨ１０．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ１０．０、より好ましくは約ｐＨ６．０〜約ｐＨ１０．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．５、およびさらにより好ましくは約ｐＨ５．５〜ｐＨ６．０で行われる。]
[0070] 一実施形態において、プロセスは、約５．３〜８．３のｐＨで行ってもよい。]
[0071] 一実施形態において、プロセスは、約６〜６．５、好ましくは約６．３のｐＨで行ってもよい。]
[0072] 適切には、ｐＨは、本発明の方法および／または使用において中性（約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０）であり得る。]
[0073] 好ましくは、酵素処理は、油および／または水のｐＨ調整なしに脱ガムプロセスにおいて起こる。それゆえに、典型的には、ｐＨは、約５．５〜７．５であろう。これは、典型的に酸性ｐＨ条件、すなわち、ｐＨ４〜５においてのみ高活性であるホスホリパーゼＡ酵素を用いる先行技術のプロセスに対して有意な優位性を生じる。それゆえに、典型的には、（例えば、ホスホリパーゼＡ酵素を用いる）先行技術のプロセスにおいて、油のｐＨは、より酸性条件へ調整しなければならない。]
[0074] 加えて、ホスホリパーゼＣ酵素との脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、ホスホリパーゼＣ酵素との前記ホスホリパーゼＡの使用と比較して、有意な利点を有し、その理由は、脂質アシルトランスフェラーゼに最適なｐＨが典型的には、ホスホリパーゼＣ酵素に最適なｐＨとはるかに良く一致するからである。それゆえに、一般的に、脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせて用いられる場合、「ｐＨ矛盾」はない。これは、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせたホスホリパーゼＡ酵素の使用と鋭く対照をなす。したがって、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、両方の酵素がそれらの最適なｐＨ範囲で、または同時に作用することができるので、有意な向上を提供する。]
[0075] 油相とガム相の分離は、任意の通常の分離方法によって行ってもよい。好ましくは、分離は、遠心分離によって行われる。]
[0076] （単独か、または好ましくはホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせてのいずれかでの）脂質アシルトランスフェラーゼの使用の一つの有意な利点は、酵素処理が、遠心分離を調節して最終の油中のリンの量を制御することを可能にすることである。理論によって縛られるつもりはないが、これは、油の粘性が、（単独か、または好ましくは、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせてのいずれかでの）脂質アシルトランスフェラーゼで処理されていない油と比較して、有意に低下しているために、達成可能である。これは、先行技術のプロセスに対して有意な進歩である。典型的には、通常の脱ガムプロセスにおいて、遠心分離は、約５０ｐｐｍの油中のリンのレベルを生じる。実際、食用油中のリンのレベルについての仕様ガイドは、それは２００ｐｐｍ未満であるべきということである。できる限り２００ｐｐｍレベルに近いリンレベルである油を有することが、現に、最適である。（単独か、または好ましくは、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせてのいずれかでの）脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、結果として、約１００〜２００ｐｐｍ、好ましくは約１７０〜１９０ｐｐｍ、より好ましくは約１８０ｐｐｍのリンレベルまで遠心分離することができる油を生じる。これらのリンレベルを与えるような遠心分離の調節は、本発明の以前では、非常に困難であり、本発明に関しては、有意な向上を提供する。]
[0077] 適切には、水は、酵素との混合の前または同時に、食用油と混合することができる。あるいは、食用油および酵素は、水との混合前に混合してもよい。]
[0078] 一実施形態において、油、水、および酵素は、同時にまたは実質的に同時に続々と、攪拌機を通って、貯蔵タンクへとポンプで注入してもよい。]
[0079] 適切には、酵素は、プロセスの間および／または終わりに不活性化し得る。]
[0080] 酵素は、油相とガム相の分離の前または後に不活性化してもよい。]
[0081] 適切には、酵素は、７５〜８５℃、または９２℃より高くで１０分間、加熱することによって熱不活性化することができる。]
[0082] 一実施形態において、適切には、酵素はガム相において不活性化されない場合がある。したがって、ガム相が収集され、インキュベートされる場合、酵素はさらに、ガム相においてリン脂質を分解する可能性がある。ガム相の延長したインキュベーション後、ガム相からさらにより多くの油を回収するためにさらなる分離を（例えば、遠心分離によって）行ってもよい。これは、油収率をなおさらに増加させることができる。]
[0083] 理論によって縛られるつもりはないが、酵素は、ガム相においてリン脂質を遊離脂肪酸へ分解し、それにしたがって、それまでリン脂質で乳化していたトリアシルグリセリドを遊離させると考えられる。これは、ガム相の粘性を低下させ、トリアシルグリセリドおよび遊離脂肪酸を、例えば、遠心分離によって、分離することを可能にする。]
[0084] 一実施形態において、適切には、本発明のプロセスは、例えば、ＮａＯＨなどのアルカリの添加なしに、行うことができる。]
[0085] 別の実施形態において、適切には、本発明のプロセスは、例えば、ＮａＯＨなどのアルカリの存在下で行うことができる。ＮａＯＨが加えられる場合、好ましくは、それは、１００ｇの油当たり約０．２ｍｌ（４％溶液）のＮａＯＨを超える量では加えられない。]
[0086] 本発明の方法および／または使用に用いるのに適した酵素は、下記の「トランスフェラーゼアッセイ（コレステロール：リン脂質）（ＴｒＵ）」を用いて決定される脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有し得る。
トランスフェラーゼ活性の決定「トランスフェラーゼアッセイ（コレステロール：リン脂質）」（ＴｒＵ）
基質：５０ｍｇのコレステロール（Ｓｉｇｍａ Ｃ８５０３）および４５０ｍｇの大豆ホスファチジルコリン（ＰＣ）、Ａｖａｎｔｉ ＃４４１６０１をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを減圧下、４０℃で蒸発させる。]
[0087] ３００ｍｇのＰＣ：コレステロール９：１を、１０ｍｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７に４０℃で分散させる。
酵素法：
２５０μｌの基質を、４０℃で、蓋を有するガラス中に加える。]
[0088] ２５μｌの酵素溶液を加え、４０℃で１０分間、撹拌しながらインキュベートする。]
[0089] 加えられた酵素は、アッセイにおいてコレステロールの２〜５％をエステル化するはずである。]
[0090] 酵素溶液の代わりに２５μｌの水を用いたブランクもまた分析する。]
[0091] １０分後、５ｍｌのヘキサン：イソプロパノール３：２を加える。]
[0092] コレステロールエステルの量を、キャリブレーションのためにステアリン酸コレステリル（Ｓｉｇｍａ Ｃ３５４９）標準を用いるＨＰＴＬＣによって分析する。]
[0093] トランスフェラーゼ活性を、アッセイ条件下での１分当たりのコレステロールエステル形成の量として計算する。]
[0094] １トランスフェラーゼ単位（ＴｒＵ）は、上記に示されたトランスフェラーゼアッセイに従った、４０℃、ｐＨ７で、１分当たりに生成されるμモルのコレステロールエステルとして定義される。]
[0095] 好ましくは、本発明の方法および使用に用いられる脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくとも２５ＴｒＵ／ｍｇ酵素タンパク質の１ｍｇの酵素当たりの特定のトランスフェラーゼ単位（ＴｒＵ）を有するであろう。]
[0096] 適切には、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、１ｇの油当たり０．０５〜５０ＴｒＵの量、適切には１ｇの油当たり０．５〜５ＴｒＵの量で投与され得る。]
[0097] より好ましくは、本発明の方法および／または使用に用いるのに適した酵素は、下記のプロトコールによって定義されるような脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有する。]
[0098] ％アシルトランスフェラーゼ活性の決定のためのプロトコール
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが加えられている食用油を、ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ２：１との酵素反応後、抽出することができ、脂質材料を含む有機相を単離し、本明細書の下記に詳述された手順に従ってＧＬＣおよびＨＰＬＣによって分析する。ＧＬＣおよびＨＰＬＣ分析から、遊離脂肪酸およびステロール／スタノールエステルの１つまたは複数の量を決定する。本発明による酵素が加えられていない対照食用油を同様に分析する。
計算：
ＧＬＣおよびＨＰＬＣ分析の結果から、遊離脂肪酸およびステロール／スタノールエステルの増加を計算することができる：
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸（酵素）−％脂肪酸（対照）
Ｍｖ脂肪酸＝脂肪酸の平均分子量
Ａ＝Δ％ステロールエステル／Ｍｖステロールエステル（ただし、Δ％ステロールエステル＝％ステロール／スタノールエステル（酵素）−％ステロール／スタノールエステル（対照）、およびＭｖステロールエステル＝ステロール／スタノールエステルの平均分子量）
トランスフェラーゼ活性は、全酵素活性のパーセンテージとして計算される。]
[0099] 遊離脂肪酸が食用油において増加している場合、それらは好ましくは、実質的に、すなわち、有意な程度まで、増加していない。これによって、遊離脂肪酸の増加が食用油の質に悪影響を及ぼさないことを意味する。]
[0100] アシルトランスフェラーゼ活性アッセイに用いられる食用油は、好ましくは、以下の方法を用いて植物ステロール（１％）およびホスファチジルコリン（２％）油を追加した大豆油である：
植物ステロールおよびホスファチジルコリンを、撹拌しながら９５℃まで加熱することによって大豆油に溶解した。その後、油を４０℃まで冷却し、酵素を加えた。水を、油相の５％の全濃度に加えた。試料を、磁力で撹拌しながら４０℃に維持し、４時間後および２０時間後、試料を取り出し、ＴＬＣによって分析した。]
[0101] アッセイについて、用いられる酵素用量は、好ましくは０．２ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油、より好ましくは０．０８ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油、好ましくは０．０１ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油である。油に存在するリン脂質のレベルおよび／またはステロールの％変換は、好ましくは０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、および２０時間後、より好ましくは２０時間後、決定される。]
[0102] 用いられる酵素が脂質アシルトランスフェラーゼ酵素である場合、好ましくは、インキュベーション時間は、少なくとも５％トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１０％トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％、２６％、２８％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７５％トランスフェラーゼ活性があることを確実にするのに有効である。]
[0103] ％トランスフェラーゼ活性（すなわち、全酵素活性のパーセンテージとしてのトランスフェラーゼ活性）は、上記で教示されたプロトコールによって決定してもよい。]
[0104] 本発明のいくつかの態様において、本明細書に用いられる場合、用語「実質的に遊離脂肪酸を増加させることなく」とは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼで処理された食用油における遊離脂肪酸の量が、例えば、通常のホスホリパーゼ酵素、例えば、Ｌｅｃｉｔａｓｅ ＵｌｔｒａＴＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）が用いられていた場合に生成した遊離脂肪酸の量と比較した場合など、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ以外の酵素が用いられていたときの食用油に生成した遊離脂肪酸の量より少ないことを意味する。]
[0105] 油において％トランスフェラーゼ活性を評価すること（上記）に加えて、またはそれの代わりに、本発明の方法に用いるのに最も好ましい脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を同定するために、「本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコール」と題した以下のアッセイを用いることができる。]
[0106] 脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコール
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下を結果として生じるものである：
ｉ）（以下の方法を用いる：植物ステロールおよびホスファチジルコリンを、撹拌しながら９５℃まで加熱することによって大豆油に溶解した。その後、油を４０℃まで冷却し、酵素を加えた。試料を、磁力で撹拌しながら４０℃に維持し、０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、および２０時間後、試料を取り出し、ＴＬＣによって分析した）植物ステロール（１％）およびホスファチジルコリン（２％）油を追加した大豆油に存在するリン脂質の除去；
ならびに／または
ｉｉ）（上記のｉ）に教示された方法を用いる）加えられたステロールのステロールエステルへの変換（％変換）。実施例２に教示されているように、ステロールおよびステロールエステルのレベルを決定するためのＧＬＣ方法を用いてもよい。]
[0107] アッセイについて、用いられる酵素用量は、０．２ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油、好ましくは０．０８ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油、好ましくは０．０１ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油であり得る。油に存在するリン脂質のレベルおよび／またはステロールの変換（％変換）は、好ましくは０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、および２０時間後、より好ましくは２０時間後、決定される。]
[0108] 脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコールにおいて、酵素処理後、好ましくは、５％の水を加え、油と十分に混合する。その後、油を、遠心分離を用いて油相と水相へ分離し（Ｂｕｃｈｏｌｄ， Ｈ．およびＬａｕｒｇｉ Ａ．−Ｇ．による「Ｅｎｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ ｏｆ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｏｉｌｓ」、Ｆｅｔｔ Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（１９９３年）、９５巻（８号）、３００〜４頁、ＩＳＳＮ：０９３１−５９８５参照）、その後、油相を、以下のプロトコール（「リン含有量についてのアッセイ」）を用いてリン含有量について分析することができる：
リン含有量についてのアッセイ
水脱ガム後の油に存在するリン脂質のレベルは、ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ９９９．１０（＞Ｌｅａｄ， Ｃａｄｍｉｕｍ， Ｚｉｎｃ， Ｃｏｐｐｅｒ， ａｎｄ Ｉｒｏｎ ｉｎ ＦｏｏｄｓＡｔｏｍｉｃ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ａｆｔｅｒ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ， Ｆｉｒｓｔ Ａｃｔｉｏｎ １９９９ ＮＭＫＬ−ＡＯＡＣ Ｍｅｔｈｏｄ）に教示された試料調製に従って油試料を最初に調製することによって決定される。その後、油中のリン脂質量を、ＡＯＡＣ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ｃａ ２０−９９：Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｉｎ ｏｉｌ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｐｌａｓｍａ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙに従って脱ガム後の油試料におけるリン含有量を分析することによって測定する。]
[0109] 本発明を用いた後の油相に存在するリンの量は、典型的には、通常の水脱ガム（すなわち、酵素なし）後の油相におけるリン含有量と有意には異ならない。]
[0110] 本発明を用いる油相における本発明を用いる油収率は、通常の水脱ガムプロセス（すなわち、酵素なし）を用いた後の油相と比較して実質的に増加している。適切には、本発明によるプロセスおよび／または使用は、酵素の添加なしに同じ水脱ガムプロセスを受けている同じ油と比較して、約０．２５〜３％、または約０．５〜２％、または約１〜２％などの約０．２５〜７％、収率が向上する。]
[0111] 驚くべきことに、本発明によるプロセスにおける酵素の添加は、酵素の添加なしであることを除いて比較可能な水脱ガムプロセスを用いて得られた比較可能な油相と比較して、油相のリン含有量を必ずしも有意に低下させることなく、油相における、有意により高い油収率を提供することが見出された。]
[0112] 適切には、油が本発明のプロセスまたは使用に従って処理されている場合の油相中のリンの量は、酵素の添加なしであることを除いて比較可能な水脱ガムプロセスを用いて得られた油相のリン含有量より０〜８０％、適切には０〜５０％、適切には０〜１０％、適切には０〜１％少なくあり得る。]
[0113] 特に、本発明によるプロセスで得られた油相は、ホスファチドおよび／またはリン脂質を除去するためにさらに脱ガムしてもよい。例えば、油相は、酵素的脱ガムおよび／または酸脱ガムを受けることができる。]
[0114] 油に存在するステロールの％変換は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％である。]
[0115] 一実施形態において、油中に存在するステロールの％変換は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも２０％である。]
[0116] いくつかの態様において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘモチーフおよび／またはＧＡＮＤＹモチーフを含み得る。]
[0117] 好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、およびアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である）を含む酵素として特徴付けられる。]
[0118] 適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、または脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の属の１つまたは複数由来の生物体から獲得可能、好ましくは獲得され得る：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＣａｎｄｉｄａ。好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の生物体から獲得可能であり、好ましくは獲得される。]
[0119] 本発明のいくつかの態様において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５として示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列におけるＮ−８０に対応する位置にアスパラギン酸残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。]
[0120] 本発明のいくつかの態様において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３５として示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列におけるＮ−８０に対応する位置にアスパラギン酸残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。]
[0121] 加えて、または代替として、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６として示されたアミノ酸配列、またはそれと７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６として示されたアミノ酸配列を含み得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。]
[0122] 加えて、または代替として、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６８として示されたアミノ酸配列、またはそれと７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６８として示されたアミノ酸配列を含み得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。]
[0123] 一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１６もしくは配列番号６８に示されたアミノ酸配列を有し、またはそれらと少なくとも７５％同一性、好ましくは、それらと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を有する。]
[0124] 一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ、またはそれと少なくとも７５％同一性、好ましくは、それと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。]
[0125] 一実施形態において、好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを配列番号１に示されたヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも７５％同一性（より好ましくは、それと、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一性）を有するヌクレオチド配列で形質転換し、前記Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを培養し、そこに産生された（１つまたは複数の）脂質アシルトランスフェラーゼを単離することによってＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに発現している脂質アシルトランスフェラーゼである。]
[0126] 本明細書に用いられる場合、用語「食用油」は、植物油を含み得る。]
[0127] 好ましくは、本発明による処理の前の食用油は、約５０〜３０００ｐｐｍ、より好ましくは約５０〜１４００ｐｐｍの範囲、より好ましくは約２００〜１４００ｐｐｍの範囲、およびさらにより好ましくは約４００〜１２００ｐｐｍの範囲の非水和可能リン含有量を含む粗製食用油である。]
[0128] 一態様において、粗製食用油は、本発明の方法を行う前に、３５０ｐｐｍより高い、より好ましくは４００ｐｐｍより高い、さらにより好ましくは５００ｐｐｍより高い、最も好ましくは６００ｐｐｍより高いリン含有量を有する。]
[0129] 好ましくは、食用油は植物油である。]
[0130] 本発明による方法によって含まれる油として、大豆油、キャノーラ油、コーン油、綿実油、パーム油、ココナッツ油、米糠油、ピーナッツ油、オリーブ油、紅花油、パーム核油、菜種油、およびヒマワリ油の１つまたは複数を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。]
[0131] 好ましくは、油は、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、およびナタネ油（キャノーラ油と呼ばれることもある）の１つまたは複数である。]
[0132] より好ましくは、油は、大豆油、ヒマワリ油、またはナタネ油の１つまたは複数である。]
[0133] 最も好ましくは、油は大豆油である。]
[0134] 本明細書で用いられる場合、「粗製油」（本明細書では、非脱ガム油とも呼ばれる）は、圧搾油もしくは抽出油、またはそれらの混合物であり得る。]
[0135] 粗製油中のホスファチド含有量は、２００〜１２００ｐｐｍの範囲、より好ましくは２５０〜１２００ｐｐｍの範囲のリン含有量に対応する０．５〜３％ｗ／ｗまで様々であり得る。]
[0136] ホスファチドは別として、粗製油はまた、低濃度の炭水化物、糖化合物、ならびにＣａ、Ｍｇ、およびＦｅの金属／ホスファチド酸複合体を含み得る。]
[0137] 有利には、本発明の方法および使用は、低水（＜５％、好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満）環境において食用油の脱ガムを可能にする。したがって、水脱ガムは、通常の水脱ガムプロセスを用いる場合より少ない水を加えることで行うことができる。]
[0138] 本発明のさらなる利点は、油相におけるステロールエステルの生成である。]
[0139] 適切には、酵素は、約０．０１〜１０ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油の範囲で投与することができ、適切には、酵素は、約０．０５〜１．５ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油の範囲、より好ましくは０．２〜１ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油で投与することができる。]
[0140] 酵素が脂質アシルトランスフェラーゼである場合、適切には、それは、約０．０１ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油〜５ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができる。一実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼは、約０．１〜約１ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができ、より好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、約０．１〜約０．５ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができ、より好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、約０．１〜約０．３ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができる。]
[0141] 酵素がホスホリパーゼである場合、適切には、それは、約０．５〜１０ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができる。一実施形態において、ホスホリパーゼは、約０．５〜５ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができ、好ましくは、ホスホリパーゼは、約０．５〜１．５ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができる。適切には、ホスホリパーゼは、約１．０〜３ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができる。]
[0142] ホスホリパーゼ活性、ＴＩＰＵ−Ｋ：
基質：５０ｍｍのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．０に溶解した、１．７５％のＬ−植物ホスファチジルコリン９５％（４４１６０１、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、６．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（＃Ｔ９２８４、Ｓｉｇｍａ）、および５ｍＭ ＣａＣｌ２。
アッセイ手順：試料、キャリブレーション、および対照を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（＃Ｔ９２８４、Ｓｉｇｍａ）に希釈した。分析をＫｏｎｅｌａｂ Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて行った。アッセイを、３０Ｃで実行した。４μＬの試料を加える前に、３４μＬの基質を１８０秒間、サーモスタットで調温した。酵素法は６００秒間続いた。酵素法中に遊離した遊離脂肪酸の量を、ＮＥＦＡＣキット（９９９−７５４０６、ＷＡＫＯ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。５６μＬのＮＥＦＡ Ａを加え、その混合物を３００秒間インキュベートした。後で、１１３μＬのＮＥＦＡ Ｂを加え、その混合物を３００秒間インキュベートした。その後、ＯＤ５２０ｎｍを測定した。酵素活性（μモルＦＦＡ／分・ｍＬ）を、標準酵素調製に基づいて計算した。]
[0143] 酵素活性ＴＩＰＵ−Ｋを、アッセイ条件下で１分当たり生成されるマイクロモル遊離脂肪酸（ＦＦＡ）として計算した。]
[0144] 本発明において、プロセスは、好ましくは、腐食性中和プロセスではない（すなわち、酸性水脱ガムプロセスではなく、および／または酸腐食性脱ガムプロセスではない）。換言すれば、プロセスは、好ましくは、（リン酸、クエン酸、アスコルビン酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、塩酸、および／または酢酸などの）酸または（ＫＯＨおよびＮａＯＨなどの）腐食剤の添加を含まず、または相当量の酸もしくは腐食剤の添加を含まない。換言すれば、酸および／または腐食剤が本発明のプロセスで加えられる場合、それらは０．００４％未満で加えられる。]
[0145] 参照を容易にするために、これらおよび本発明のさらなる態様は、今、適当なセクション見出しの下、論じられている。しかしながら、各セクション下の教示は、必ずしもそれぞれの特定のセクションに限定されるわけではない。]
[0146] ホスホリパーゼＣ
上記で述べたように、リン脂質分解酵素（好ましくは脂質アシルトランスフェラーゼ）は、ホスホリパーゼＣ（Ｅ．Ｃ．３．１．４．３）と組み合わせて用いることができる。]
[0147] ホスホリパーゼＣは任意の入手可能なホスホリパーゼＣ酵素であってもよく、以下のホスホリパーゼＣ酵素の１つまたは複数から選択してもよい：Ｐｕｒｉｆｉｎｅ（登録商標）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ、ＵＳから入手可能）；（Ｓｉｇｍａから入手可能なホスホリパーゼＣ、Ｒｅｆ Ｐ７６３３などの）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のホスホリパーゼＣ；（Ｓｉｇｍａから入手可能なホスホリパーゼＣ、Ｒｅｆ Ｐ６６２１などの）Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ由来のホスホリパーゼＣ；（参照により本明細書に組み入れられている）ＷＯ２００８／０３６８６３に教示されたホスホリパーゼＣ酵素。]
[0148] 利点
本発明の一つの利点は、油収率の増加が水脱ガムプロセスの終わりに得られることである。油収率の増加は、本発明による酵素の添加がないことを除いて比較可能な水脱ガムプロセスと比較される。]
[0149] 理論によって縛られるつもりはないが、収率の増加は、リン脂質のガム相への除去によって引き起こされる乳化効果の減少による可能性がある。リン脂質は良い乳化剤であり、トリアシルグリセリドと乳化している可能性があり、それゆえに、リン脂質がガム相へ除去された場合、トリアシルグリセリド（油）の形をとる一部の油もまた除去される。リン脂質の分解によるガム相の粘性の低下が、ガム相への油の損失を防ぐのを助ける（ガム相と油の分離がはるかに容易であるため）。]
[0150] （理論によって縛られるつもりはないが、）加えて、または代替として、脂質アシルトランスフェラーゼが本発明に従って用いられる場合、脂肪酸部分をリン脂質からステロールへ転移することによってステロールエステルが形成される。脂質アシルトランスフェラーゼ酵素反応によるステロールにエステル化されるこの脂肪酸部分は、油相に見出され、ガム相には見出されない。通常の水脱ガムプロセス（脂質アシルトランスフェラーゼの添加なし）において、これらの脂肪酸部分はガム相へと失われる。]
[0151] 本発明のさらなる利点は、脂質アシルトランスフェラーゼが用いられた場合、水脱ガムプロセスにおけるｐＨ（約ｐＨ５．０または５．５〜約ｐＨ６．５または７）を調整する必要がないことである。このｐＨは、脂質アシルトランスフェラーゼの高反応性をもたらす。]
[0152] 脂質アシルトランスフェラーゼを用いた場合の本発明のもう一つの利点は、リン脂質由来の脂肪酸が、ステロール上に転移され、ステロールエステルを形成することである。これは、それ自体で、油相における収率の０．１〜０．１５％の増加に寄与し得る。]
[0153] 本発明のさらなる利点（特に、脂質アシルトランスフェラーゼを用いた場合）は、ガム相が、本発明による酵素の添加がないことを除いて比較可能な水脱ガムプロセスからのガム相と比較して、粘性が低いことである。ガム相におけるより低い粘性は、結果として、油相から分離すること、すなわち、遠心分離によって分離することがより容易であることをもたらす。]
[0154] 加えて、ガム相は、水含有量がより少ない可能性があり、それゆえに、完全に乾燥させることがより容易であり得る。]
[0155] 本発明のなおさらなる利点は、ガム相においてトリグリセリド濃度の低下があることである。]
[0156] 本発明のプロセスは、結果として、処理工場における汚れの減少をもたらすことができる。これは、工場の清掃がより容易であり得ることを意味する。]
[0157] 理論によって縛られるつもりはないが、驚くべきことに、脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドを生成するための受容体分子として、（ホスホリパーゼＣの反応によって生成した）ジグリセリドを用い得ることを見出している。したがって、脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、これらの酵素間の相互作用が、いずれかの酵素のみを含む比較可能な油または酵素を含まない比較可能な油と比較して、両方の酵素を含む油においてトリグリセリドの量の相乗的な増加を生じる。脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、これらの酵素間の相互作用が、いずれかの酵素のみを含む比較可能な油または酵素を含まない比較可能な油と比較して、両方の酵素を含む油における油収率の相乗的な増加を生じる。]
[0158] ジグリセリドが油の「発煙点」にマイナスの影響を及ぼし得、および／またはより飽和した脂肪供給源の結晶化性質にマイナスの影響を及ぼし得るという理由のため、（ホスホリパーゼＣが単独で用いられた場合、起こり得る）油におけるジグリセリドの蓄積が油にとって有害であり得るので、これらの酵素の組合せの使用は、ホスホリパーゼＣ単独の使用に対して有意な優位性を有する。]
[0159] したがって、本発明において、脂質アシルトランスフェラーゼの使用（特に、ホスホリパーゼＣと組み合わせた場合）のもう一つの利点は、脂質アシルトランスフェラーゼなしでの比較可能な油と比較して、および／または特に、ホスホリパーゼＣ単独で処理された比較可能な油と比較して、油におけるジグリセリド量を低下させ得ることである。]
[0160] 本発明による（１つまたは複数の）酵素の使用は、プロセスにおいて必要とされる水の量を約１％未満まで低下させることができる。これは、水脱ガムプロセスにおいて有意な財政的利点を生むことができる。それゆえに、水の量を約１％未満まで低下させ得ることは、有意な費用低減をもたらすことができる。]
[0161] 好ましくは、酵素処理は、油および／または水のｐＨ調整なしに脱ガムプロセスで起こる。これは、典型的には酸性ｐＨ条件においてのみ高活性であるホスホリパーゼＡ酵素を用いる先行技術のプロセスに対する有意な優位性を生じる。典型的には、（例えば、ホスホリパーゼＡ酵素を用いる）先行技術のプロセスにおいて、油のｐＨは、脱ガムプロセスの前および／または間に調整されなければならない。これは本発明に関して必要ではない。]
[0162] 加えて、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、ホスホリパーゼＣ酵素との前記ホスホリパーゼＡの使用と比較して、有意な利点を有し、その理由は、脂質アシルトランスフェラーゼに最適なｐＨが典型的には、ホスホリパーゼＣ酵素に最適なｐＨとはるかに良く一致するからである。それゆえに、一般的に、脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせて用いられる場合、「ｐＨ矛盾」はない。これは、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせたホスホリパーゼＡ酵素の使用と鋭く対照をなす。したがって、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、両方の酵素がそれらの最適なｐＨ範囲で、または同時に作用することができるので、有意な向上を提供する。]
[0163] 特に、ガム相の（単独かまたはホスホリパーゼＣと組み合わせてのいずれかの）脂質アシルトランスフェラーゼでの処理を含む方法において、このプロセスの終わりに生成する「酸性油」は、食事に加えられる通常のガム相より高い価格で販売することができる。加えて、（酸性油の分離後の）残っているガム相は、驚くべきことに、通常のガムより高いリンレベルを有することが見出されており、したがって、有機リンの供給源として用いることができる。]
[0164] 宿主細胞
宿主生物体は、原核生物または真核生物であり得る。]
[0165] 本発明の一実施形態において、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、宿主細胞、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ宿主細胞などの細菌細胞に発現する。]
[0166] 代替の宿主細胞は、例えば、真菌、酵母、または植物であってもよい。]
[0167] Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ宿主細胞の使用によって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの他の生物体と比較した場合、脂質アシルトランスフェラーゼの発現の増加がもたらされることが見出されている。]
[0168] Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ由来の脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ、それぞれにおける発現に最適であるように設計されたいくつかの通常の発現ベクターへ挿入されている。しかしながら、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓにおいては、非常に低いレベルのみが検出された。発現レベルは１μｇ／ｍｌより低く、商業的製造を開始するのに十分なタンパク質を生じる細胞を選択することは不可能であった（結果示さず）。対照的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓは、経済的に実行可能な製造として魅力があるタンパク質レベルを産生することができた。]
[0169] 特に、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにおける発現は、ａｐｒＥプロモーターの調節下のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける発現より約１００倍高く、またはＡ４プロモーターの調節下で、かつセルロースに融合したＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓにおける発現より約１００倍高い（本明細書では結果を示さず）ことが見出されている。]
[0170] 宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ以外の任意のＢａｃｉｌｌｕｓ細胞であってもよい。好ましくは、前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、以下の種の１つ由来である：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、またはＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ。]
[0171] 本発明に関しての用語「宿主細胞」は、本明細書に定義されているような脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列かまたは本明細書に定義されているような発現ベクターのいずれかを含む任意の細胞を含み、それは、本明細書に定義されているような特定の性質を有する脂質アシルトランスフェラーゼの組換え産生に用いられる。]
[0172] 適切には、宿主細胞は、プロテアーゼ欠損もしくはプロテアーゼマイナス菌株、および／またはα−アミラーゼ欠損もしくはα−アミラーゼマイナス菌株であってもよい。]
[0173] 本明細書に用いられる場合、用語「異種性」とは、別々の遺伝源または種由来の配列を意味する。異種性配列は、非宿主配列、改変配列、異なる宿主細胞菌株由来の配列、または宿主細胞の異なる染色体位置由来の同種配列である。]
[0174] 「同種」配列は、同じ遺伝源または種に見出される配列である、すなわち、それは宿主細胞の関連種に自然発生している。]
[0175] 本明細書に用いられる場合、用語「組換え脂質アシルトランスフェラーゼ」とは、脂質アシルトランスフェラーゼが、遺伝子組換えによって産生されていることを意味する。例えば、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、クローニングベクターへ挿入されており、その結果として、異種性脂質アシルトランスフェラーゼの存在によって特徴付けられたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ細胞を生じる。]
[0176] 制御配列
適用によっては、本発明の方法および／または使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼ配列は、選択された宿主細胞（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ細胞など）によるなどのヌクレオチド配列の発現を提供する能力がある制御配列に、それをコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結することによって、得ることができる。]
[0177] 例として、そのような制御配列に作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、すなわち、そのベクターは発現ベクターであり、それを用いることができる。]
[0178] 用語「作動可能に連結された」とは、記載された構成要素が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、調節配列と適合性の条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。]
[0179] 用語「制御配列」は、プロモーターおよびエンハンサーおよび他の発現制御シグナルを含む。]
[0180] 用語「プロモーター」は、当技術分野の通常の意味で用いられ、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。]
[0181] 本明細書で定義されているような特定の性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現の増強はまた、制御領域の選択、例えば、天然ではその酵素をコードするヌクレオチド配列についての制御領域ではないプロモーター、分泌リーダー、および終結領域によって達成してもよい。]
[0182] 適切には、本発明のヌクレオチド配列を、少なくともプロモーターに作動可能に連結することができる。]
[0183] 適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、終結配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。本発明のベクター、宿主細胞、方法、および／または使用のいずれか一つに用いる適切な終結配列の例として、α−アミラーゼ終結配列（例えば、]
[0184] −配列番号６４）、アルカリプロテアーゼ終結配列（例えば、]
[0185] −配列番号６５）、グルタミン酸特異的終結配列（例えば、]
[0186] −配列番号６６）、レバナーゼ終結配列（例えば、]
[0187] −配列番号６７）、およびスブチリシンＥ終結配列（例えば、]
[0188] ）が挙げられる。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼターミネーターなどのα−アミラーゼターミネーターに作動可能に連結してもよい。]
[0189] プロモーター
本発明に従って用いられるプロモーター配列は、脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列と異種性でも同種性でもよい。]
[0190] プロモーター配列は、最適な宿主細胞において脂質アシルトランスフェラーゼの発現を指示する能力がある任意のプロモーター配列であってもよい。]
[0191] 適切には、プロモーター配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、例えば、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓと同種であり得る。好ましくは、プロモーター配列は最適な宿主細胞と同種である。]
[0192] 適切には、プロモーター配列は、宿主細胞と同種であり得る。「宿主細胞と同種の」とは、その宿主生物体内から生じること；すなわち、その宿主生物体で自然に見出されるプロモーター配列を意味する。]
[0193] 適切には、プロモーター配列は、α−アミラーゼプロモーター、プロテアーゼプロモーター、スブチリシンプロモーター、グルタミン酸特異的プロテアーゼプロモーター、およびレバンスクラーゼプロモーターをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択することができる。]
[0194] 適切には、プロモーター配列は、ＬＡＴ（例えば、ＡｍｙＬとしても公地である、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のα−アミラーゼプロモーター）、ＡｐｒＬ（例えば、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇプロモーター）、ＥｎｄｏＧｌｕＣ（例えば、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のグルタミン酸特異的プロモーター）、ＡｍｙＱ（例えばＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼプロモーター由来のαアミラーゼプロモーター）、およびＳａｃＢ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼプロモーター）をコードするヌクレオチド配列であり得る。]
[0195] 本発明の方法において核酸配列の転写を指示するのに適したプロモーターの他の例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター（ａｐｒＨ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成型アミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子のプロモーター（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター、ならびに／またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ亜種ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子のプロモーターが挙げられる。]
[0196] 好ましい実施形態において、プロモーター配列は、（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼプロモーターなどの）α−アミラーゼプロモーターである。好ましくは、プロモーター配列は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼプロモーターの−３５〜−１０配列を含む−図５３および５５参照。] 図５３
[0197] 「−３５〜−１０配列」は、転写開始部位に対する位置を記載する。「−３５」および「−１０」は、ボックス、すなわち、いくつかのヌクレオチドであり、それぞれが６個のヌクレオチドを含み、これらのボックスは１７個のヌクレオチドによって隔てられている。これらの１７個のヌクレオチドは、「スペーサー」と呼ばれることが多い。これは、図５５に示されており、図中、−３５ボックスおよび−１０ボックスは下線が引かれている。誤解を避けるために言えば、「−３５〜−１０配列」が本明細書に用いられる場合、それは、−３５ボックスの始めから−１０ボックスの終わりまで、すなわち、−３５ボックス、１７ヌクレオチド長のスペーサー、および−１０ボックスを含む配列を指す。] 図５５
[0198] シグナルペプチド
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現による宿主細胞によって産生される脂質アシルトランスフェラーゼは、用いられる配列および／もしくはベクターに依存して、分泌されてもよいし、細胞内に含まれてもよい。]
[0199] シグナル配列は、特定の細胞膜を通ってのコード配列の分泌を指示するために用いることができる。シグナル配列は、脂質アシルトランスフェラーゼコード配列にとって天然でも外来でもよい。例えば、シグナルペプチドコード配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアミラーゼ遺伝子またはプロテアーゼ遺伝子から得ることができる。]
[0200] 適切なシグナルペプチドコード配列は、以下の遺伝子の１つまたは複数から得ることができる：マルトース生成型α−アミラーゼ遺伝子、スブチリシン遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、中性プロテアーゼ遺伝子、ｐｒｓＡ遺伝子、および／またはアシルトランスフェラーゼ遺伝子。]
[0201] 好ましくは、シグナルペプチドは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓアシルトランスフェラーゼ（例えば、ｍｋｋｗｆｖｃｌｌｇｌｉａｌｔｖｑａ−配列番号２１）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓスブチリシン（例えば、ｍｒｓｋｋｌｗｉｓｌｌｆａｌｔｌｉｆｔｍａｆｓｎｍｓａｑａ−配列番号２２）、またはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓスブチリシン（例えば、ｍｍｒｋｋｓｆｗｆｇｍｌｔａｆｍｌｖｆｔｍｅｆｓｄｓａｓａ−配列番号２３）のシグナルペプチドである。適切には、シグナルペプチドは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼのシグナルペプチドであり得る。]
[0202] しかしながら、最適なＢａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞（好ましくは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ宿主細胞）の分泌経路へ発現した脂質アシルトランスフェラーゼを向ける能力がある任意のシグナルペプチドコード配列を用いてもよい。]
[0203] 本発明のいくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最適な脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結してもよい。]
[0204] 最適な脂質アシルトランスフェラーゼを、融合タンパク質として、本明細書に定義されているような宿主細胞で発現させてもよい。]
[0205] 発現ベクター
用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロの発現の能力がある構築物を意味する。]
[0206] 好ましくは、発現ベクターは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ宿主などの生物体のゲノムに組み入れられる。用語「組み入れられる」とは、好ましくは、ゲノムへの安定的な組み入れを網羅する。]
[0207] 本明細書に定義されているような脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列はベクターに存在してもよく、そのベクター内では、制御配列が、（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどの）適切な宿主生物体によってヌクレオチド配列の発現を提供することができるように、ヌクレオチド配列が制御配列に作動可能に連結されている、すなわち、そのベクターは発現ベクターである。]
[0208] 本発明のベクターは、本明細書に定義されているような脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現を提供するように上記のような適切な宿主細胞へ形質転換することができる。]
[0209] ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターまたはファージベクター、ゲノム挿入断片の選択は、それが導入されることになっている宿主細胞に依存することが多いであろう。本発明は、等価な機能の働きをし、かつ当技術分野において公知である、または公知になる発現ベクターの他の形を網羅することができる。]
[0210] いったん最適な宿主細胞へ形質転換されたならば、ベクターは、宿主細胞のゲノムとは無関係に複製および機能してもよいし、ゲノム自体へと統合されてもよい。]
[0211] ベクターは、抗生物質抵抗性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリン抵抗性を与える遺伝子などの１つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。あるいは、選択は、（ＷＯ９１／１７２４３に記載されているように）同時形質転換によって達成してもよい。]
[0212] ベクターは、例えば、ＲＮＡの産生のためにインビトロで用いてもよいし、宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するために用いてもよい。]
[0213] ベクターは、そのベクターが問題の宿主細胞において複製することを可能にするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。そのような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、およびｐＩＪ７０２の複製起点である。]
[0214] 脂質アシルトランスフェラーゼ
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、天然の脂質アシルトランスフェラーゼをコードしてもよいし、変種脂質アシルトランスフェラーゼをコードしてもよい。]
[0215] 本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、天然の脂質アシルトランスフェラーゼでも、変種の脂質アシルトランスフェラーゼでもよい。]
[0216] 例えば、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ＷＯ２００４／０６４５３７、ＷＯ２００４／０６４９８７、ＷＯ２００５／０６６３４７、またはＷＯ２００６／００８５０８に記載されているようなものであってもよい。これらの文書は参照により本明細書に組み入れられている。]
[0217] 本明細書に用いられる場合、用語「脂質アシルトランスフェラーゼ」は、好ましくは、アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素（一般的には、Ｅ．Ｃ．２．３．１．ｘ．、例えば、２．３．１．４３として分類される）を意味し、その活性によって酵素は、アシル基を脂質から以下のうちの１つまたは複数などの１つまたは複数の受容体基質へ転移させる能力がある：ステロール、スタノール、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、アスコルビン酸および／またはグリセロールなどの糖アルコール−好ましくは、グリセロールおよび／またはコレステロールなどのステロール。]
[0218] 好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基を（本明細書に定義されているような）リン脂質から、アスコルビン酸および／またはグリセロールおよび／またはステロール、好ましくはグリセロールまたはステロール、最も好ましくはステロール（例えば、コレステロール）などの糖アルコールへ転移させる能力がある脂質アシルトランスフェラーゼである。]
[0219] いくつかの態様について、本発明による「アシル受容体」は、例えば、多価アルコールなどのヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む任意の化合物であってもよく、それらには、グリセロール；ステロール；スタノール；炭水化物；フルーツ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、およびアスコルビン酸を含むヒドロキシ酸；タンパク質、または例えば、アミノ酸、タンパク質加水分解産物、およびペプチド（部分的に加水分解されたタンパク質）などのそれらのサブユニット；ならびにそれらの混合物および誘導体が挙げられる。好ましくは、本発明による「アシル受容体」は水ではない。]
[0220] アシル受容体は、好ましくは、モノグリセリドではない。]
[0221] 一実施形態において、アシル受容体はジグリセリドであり得る。]
[0222] 一態様において、本発明の方法および／または使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくは、アシル基を脂質からステロールおよび／またはスタノールへ転移させることができる。]
[0223] 別の態様において、本発明の方法および／または使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基を脂質からステロールおよび／またはスタノールへ転移させることができるだけでなく、加えて、アシル基を脂質から以下のうちの１つまたは複数へ転移させることができる：炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、グリセロール、脂肪アルコール。]
[0224] 適切には、アシル受容体は、油において自然に見出すことができる。あるいは、アシル受容体を油に付加してもよい（例えば、アシル受容体は油にとって外来性であってもよい）。例えば、いくつかの実施形態において、ステロールおよび／またはスタノールは、脱ガムプロセスの前または間に油に付加してもよい。これは、アシル受容体の量がアシルトランスフェラーゼ反応への律速である場合には、特に重要である。アシル受容体の添加は、アシル受容体が添加されない場合の油と比較して、遊離脂肪酸の低下および／またはアシル受容体エステルのより高い形成をもたらすことができる。]
[0225] 好ましくは、脂質アシルが作用する脂質基質は、以下の脂質の１つまたは複数である：レシチン、例えば、ホスファチジルコリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質。]
[0226] この脂質基質は、本明細書では、「脂質アシル供与体」と呼ぶ場合がある。本明細書で用いられる場合、用語「レシチン」は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロールを含む。]
[0227] 本発明に用いる好ましい脂質アシルトランスフェラーゼは、油環境におけるリン脂質への高いリン脂質加水分解性活性または高いリン脂質トランスフェラーゼ活性などの高活性を有するものとして同定され、最も好ましくは、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質からステロールへの高いトランスフェラーゼ活性を有する。]
[0228] 上記で詳述しているように、本発明の方法に用いるのに適した他のアシルトランスフェラーゼは、ｐＦａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号１）のアラインメントおよび／またはＧＤＳｘアシルトランスフェラーゼ、例えば、配列番号２８に対するアラインメントによってＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ、およびＨＰＴブロックの存在を同定することにより同定することができる。脱ガムについてのそれらの適合性を評価する、すなわち、全酵素活性の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましくは少なくとも９８％のトランスフェラーゼ活性を有する酵素を同定するために、そのようなアシルトランスフェラーゼは、本明細書の上記に詳述された「％アシルトランスフェラーゼ活性の決定のためのプロトコール」アッセイを用いて試験される。]
[0229] いくつかの態様について、好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドおよび／または１−モノグリセリドおよび／または２−モノグリセリドに作用する能力がない、または実質的に能力がない脂質アシルトランスフェラーゼである。]
[0230] いくつかの態様について、好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さない、または有意なトリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さない脂質アシルトランスフェラーゼである。]
[0231] トリグリセリドを加水分解する能力（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３活性）は、オリーブ油およびｐＨ６．５の代わりに、ヒマワリ油およびｐＨ５．５へと改変されたＦｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｄｅｘ（第３版、１９８１年、４９２〜４９３頁）に従って決定されるリパーゼ活性によって決定することができる。リパーゼ活性は、ＬＵＳ（リパーゼ単位ヒマワリ）として測定され、１ＬＵＳは、上記のアッセイ条件下で、ヒマワリ油から１分間当たり１μモルの脂肪酸を遊離することができる酵素量として定義される。あるいは、ＷＯ９８４５４５３に定義されているようなＬＵＴアッセイを用いてもよい。この参考文献は、参照により本明細書に組み入れられている。]
[0232] 本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドに作用する能力が実質的にない脂質アシルトランスフェラーゼであり得、１０００未満のＬＵＳ／ｍｇ、例えば、３００ＬＵＳ／ｍｇ未満などの５００ＬＵＳ／ｍｇ未満、好ましくは２００ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは１００ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは５０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは２０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは、５ＬＵＳ／ｍｇ未満、２ＬＵＳ／ｍｇ未満などの１０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは１ＬＵＳ／ｍｇ未満を有し得る。あるいは、ＬＵＴ／ｍｇ活性は、３００ＬＵＳ／ｍｇ未満などの５００ＬＵＳ／ｍｇ未満、好ましくは２００ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは１００ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは５０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは２０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは、５ＬＵＳ／ｍｇ未満、２ＬＵＳ／ｍｇ未満などの１０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは１ＬＵＳ／ｍｇ未満である。]
[0233] 本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、モノグリセリドに作用する能力が実質的にない脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。これは、ＬＵＳアッセイにおいてヒマワリ油の代わりに、モノオレエート（Ｍ７７６５ １−オレオイル−ｒａｃ−グリセロール９９％）を用いることによって決定することができる。１ＭＧＨＵは、アッセイ条件下でモノグリセリドから１分間当たり１μモルの脂肪酸を遊離することができる酵素量として定義される。]
[0234] 本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドに作用する能力が好ましくは実質的にない脂質アシルトランスフェラーゼであり、５０００未満のＭＧＨＵ／ｍｇ、例えば、１０００ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、例えば、３００ＭＧＨＵ／ｍｇ未満などの５００ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、好ましくは２００ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、より好ましくは１００ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、より好ましくは５０ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、より好ましくは２０ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、より好ましくは、５ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、２ＭＧＨＵ／ｍｇ未満などの１０ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、より好ましくは１ＭＧＨＵ／ｍｇ未満を有し得る。]
[0235] 適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、その脂質アシルトランスフェラーゼ活性に加えて、以下のホスホリパーゼ活性の１つまたは複数も示し得る脂質アシルトランスフェラーゼである：ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）および／またはホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）。脂質アシルトランスフェラーゼはまた、ホスホリパーゼＢ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．５）を有してもよい。]
[0236] 適切には、いくつかの態様について、脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基をリン脂質からスタノールおよび／またはステロール、好ましくはコレステロールへ転移させる能力があり得る。]
[0237] いくつかの態様について、好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基をリン脂質からステロールおよび／またはスタノールへ転移させ、少なくともステロールエステルおよび／またはスタノールエステルを形成する能力がある脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。]
[0238] したがって、一実施形態において、本発明による「アシル受容体」は、植物ステロール／スタノールであり得る。]
[0239] 好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の判定基準を用いて特徴付けることができる：
酵素は、脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移されて、新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義され得るアシルトランスフェラーゼ活性を有する；および
酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、ただし、Ｘが以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である。]
[0240] 好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸは、ＬまたはＹである。より好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸは、Ｌである。したがって、好ましくは、本発明による酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＬを含む。]
[0241] ＧＤＳＸモチーフは、４個の保存されたアミノ酸で構成される。好ましくは、モチーフ内のセリンは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の触媒性セリンである。適切には、ＧＤＳＸモチーフのセリンは、ＢｒｕｍｌｉｋおよびＢｕｃｋｌｅｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９６年４月、１７８巻７号、２０６０〜２０６４頁）に教示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＳｅｒ−１６に対応する位置にあり得る。]
[0242] タンパク質が本発明によるＧＤＳＸモチーフを有するかどうかを決定するために、配列は、好ましくは、参照により本明細書に組み入れられている、ＷＯ２００４／０６４５３７またはＷＯ２００４／０６４９８７に教示された手順に従ってｐｆａｍデータベースの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）と比較される。]
[0243] 好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を用いて整列させることができる（十分な説明として、ＷＯ２００４／０６４５３７またはＷＯ２００４／０６４９８７参照）。]
[0244] 好ましくは、ｐｆａｍ００６５７ドメインファミリーの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）との正の一致は、本発明によるＧＤＳＬまたはＧＤＳＸドメインの存在を示す。]
[0245] 好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列させた場合、本発明の方法または使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、以下、ＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック、ＨＰＴブロックの少なくとも１個、好ましくは１個より多く、好ましくは２個より多くを有することができる。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘブロックおよびＧＡＮＤＹブロックを有することができる。あるいは、酵素は、ＧＤＳｘブロックおよびＨＰＴブロックを有してもよい。好ましくは、酵素は、少なくともＧＤＳｘブロックを含む。さらなる詳細について、ＷＯ２００４／０６４５３７またはＷＯ２００４／０６４９８７参照。]
[0246] 好ましくは、ＧＡＮＤＹモチーフの残基は、ＧＡＮＤＹ、ＧＧＮＤＡ、ＧＧＮＤＬから選択され、最も好ましくはＧＡＮＤＹである。]
[0247] 好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列した場合、本発明の方法または使用に用いる酵素は、参照Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａポリペプチド配列、すなわち、配列番号１と比較した場合の以下のアミノ酸残基：２８ｈｉｄ、２９ｈｉｄ、３０ｈｉｄ、３１ｈｉｄ、３２ｇｌｙ、３３Ａｓｐ、３４Ｓｅｒ、３５ｈｉｄ、１３０ｈｉｄ、１３１Ｇｌｙ、１３２Ｈｉｄ、１３３Ａｓｎ、１３４Ａｓｐ、１３５ｈｉｄ、３０９Ｈｉｓの少なくとも１個、好ましくは１個より多く、好ましくは２個より多く、好ましくは３個より多く、好ましくは４個より多く、好ましくは５個より多く、好ましくは６個より多く、好ましくは７個より多く、好ましくは８個より多く、好ましくは９個より多く、好ましくは１０個より多く、好ましくは１１個より多く、好ましくは１２個より多く、好ましくは１３個より多く、好ましくは１４個より多くを有する。]
[0248] ｐｆａｍ００６５７ＧＤＳＸドメインは、このドメインを有するタンパク質を他の酵素から区別する独特な識別子である。]
[0249] ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列は、配列番号２として図３に提示されている。これは、ｐｆａｍファミリー００６５７、データベースバージョン６の同定に由来しており、それはまた、本明細書では、ｐｆａｍ００６５７．６と呼ばれることもある。] 図３
[0250] コンセンサス配列は、ｐｆａｍデータベースのさらなるリリースを用いることによってアップデートすることができる（例えば、ＷＯ２００４／０６４５３７またはＷＯ２００４／０６４９８７参照）。]
[0251] 一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の判断基準を用いて特徴付けることができる脂質アシルトランスフェラーゼである：
（ｉ）酵素は、脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移されて、新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義され得るアシルトランスフェラーゼ活性を有する；
（ｉｉ）酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、ただし、Ｘが以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である；
（ｉｉｉ）酵素は、Ｈｉｓ−３０９を含み、または図２および４（配列番号１または配列番号３）に示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む。] 図２
[0252] 好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのアミノ酸残基はＬである。]
[0253] 配列番号３または配列番号１において、最初の１８個のアミノ酸残基は、シグナル配列を形成する。シグナル配列を含むタンパク質である完全長配列のＨｉｓ−３０９は、そのタンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＨｉｓ−２９１と等しい。]
[0254] 一実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の触媒性三連構造：Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、およびＨｉｓ−３０９を含み、または図４（配列番号３）もしくは図２（配列番号１）に示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、およびＨｉｓ−３０９に対応する位置に、それぞれ、セリン残基、アスパラギン酸残基、およびヒスチジン残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。上記で述べているように、配列番号３または配列番号１に示された配列において、最初の１８個のアミノ酸残基はシグナル配列を形成する。シグナル配列を含むタンパク質である完全長配列のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、およびＨｉｓ−３０９は、そのタンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＳｅｒ−１６、Ａｓｐ−２８８、およびＨｉｓ−２９１と等しい。図３（配列番号２）に示されているように、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列において、活性部位残基は、Ｓｅｒ−７、Ａｓｐ−３４５、およびＨｉｓ−３４８に対応する。] 図２ 図３ 図４
[0255] 一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の判断基準を用いて特徴付けることができる脂質アシルトランスフェラーゼである：
酵素は、第１の脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移されて、新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義され得るアシルトランスフェラーゼ活性を有する；および
酵素は、少なくともＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４、およびＨｉｓ−３０９を含み、または配列番号３もしくは配列番号１に示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、およびＨｉｓ−３０９、それぞれに対応する位置にグリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸、およびヒスチジン残基を含む。]
[0256] 適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のヌクレオチド配列の１つによってコードすることができる：
（ａ）配列番号３６として示されたヌクレオチド配列（図２９参照）；
（ｂ）配列番号３８として示されたヌクレオチド配列（図３１参照）；
（ｃ）配列番号３９として示されたヌクレオチド配列（図３２参照）；
（ｄ）配列番号４２として示されたヌクレオチド配列（図３５参照）；
（ｅ）配列番号４４として示されたヌクレオチド配列（図３７参照）；
（ｆ）配列番号４６として示されたヌクレオチド配列（図３９参照）；
（ｇ）配列番号４８として示されたヌクレオチド配列（図４１参照）；
（ｈ）配列番号４９として示されたヌクレオチド配列（図５７参照）；
（ｉ）配列番号５０として示されたヌクレオチド配列（図５８参照）；
（ｊ）配列番号５１として示されたヌクレオチド配列（図５９参照）；
（ｋ）配列番号５２として示されたヌクレオチド配列（図６０参照）；
（ｌ）配列番号５３として示されたヌクレオチド配列（図６１参照）；
（ｍ）配列番号５４として示されたヌクレオチド配列（図６２参照）；
（ｎ）配列番号５５として示されたヌクレオチド配列（図６３参照）；
（ｏ）配列番号５６として示されたヌクレオチド配列（図６４参照）；
（ｐ）配列番号５７として示されたヌクレオチド配列（図６５参照）；
（ｑ）配列番号５８として示されたヌクレオチド配列（図６６参照）；
（ｒ）配列番号５９として示されたヌクレオチド配列（図６７参照）；
（ｓ）配列番号６０として示されたヌクレオチド配列（図６８参照）；
（ｔ）配列番号６１として示されたヌクレオチド配列（図６９参照）；
（ｕ）配列番号６２として示されたヌクレオチド配列（図７０参照）；
（ｖ）配列番号６３として示されたヌクレオチド配列（図７１参照）；
（ｗ）または
配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、もしくは配列番号６３として示された配列のいずれか一つと７０％以上、好ましくは７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。] 図２９ 図３１ 図３２ 図３５ 図３７ 図３９ 図４１ 図５７ 図５８ 図５９
[0257] 適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、または配列番号６３として示された配列のいずれか一つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有し得る。]
[0258] 一実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６２、および配列番号６３として示された配列のいずれか一つと７０％以上、好ましくは７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６２、および配列番号６３として示された配列のいずれか一つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有し得る。]
[0259] 一実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４９として示された配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。]
[0260] 適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列の１つまたは複数を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る：
（ｉ）配列番号６８として示されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号３として示されたアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号４として示されたアミノ酸配列
（ｉｖ）配列番号５として示されたアミノ酸配列
（ｖ）配列番号６として示されたアミノ酸配列
（ｖｉ）配列番号７として示されたアミノ酸配列
（ｖｉｉ）配列番号８として示されたアミノ酸配列
（ｖｉｉｉ）配列番号９として示されたアミノ酸配列
（ｉｘ）配列番号１０として示されたアミノ酸配列
（ｘ）配列番号１１として示されたアミノ酸配列
（ｘｉ）配列番号１２として示されたアミノ酸配列
（ｘｉｉ）配列番号１３として示されたアミノ酸配列
（ｘｉｉｉ）配列番号１４として示されたアミノ酸配列
（ｘｉｖ）配列番号１として示されたアミノ酸配列
（ｘｖ）配列番号１５として示されたアミノ酸配列
（ｘｖｉ）配列番号１６として示されたアミノ酸配列
（ｘｖｉｉ）配列番号１７として示されたアミノ酸配列
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１８として示されたアミノ酸配列
（ｘｉｘ）配列番号３４として示されたアミノ酸配列
（ｘｘ）配列番号３５として示されたアミノ酸配列、または
配列番号６８、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、もしくは配列番号３５として示された配列のいずれか一つと７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列。]
[0261] 適切には、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６８、もしくは配列番号３、もしくは配列番号４、もしくは配列番号１、もしくは配列番号１５、もしくは配列番号１６、もしくは配列番号３４、もしくは配列番号３５として示されたアミノ酸配列を含むか、または配列番号６８として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号３として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号４として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号１として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号１５として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号１６として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号３４として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号３５として示されたアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかのいずれかである脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。]
[0262] 適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６８、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、または配列番号３５として示された配列のいずれか一つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。]
[0263] 適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列の１つまたは複数を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る：
（ａ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基１〜１００位として示されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基１０１〜２００位として示されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基２０１〜３００位として示されたアミノ酸配列；または
（ｄ）上記の（ａ）〜（ｃ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか一つに対して７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。]
[0264] 適切には、本発明の方法および使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列の１つまたは複数を含み得る：
（ａ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基２８〜３９位として示されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基７７〜８８位として示されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基１２６〜１３６位として示されたアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基１６３〜１７５位として示されたアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基３０４〜３１１位として示されたアミノ酸配列；または
（ｆ）上記の（ａ）〜（ｅ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか一つに対して７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。]
[0265] 一態様において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、ＥＰ１２７５７１１に教示されているようなＣａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼであり得る脂質アシルトランスフェラーゼである。したがって、一態様において、本発明の方法および使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１７または配列番号１８に教示されたアミノ酸配列の１つを含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。]
[0266] 非常に好ましくは、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１６として示されたアミノ酸配列、または配列番号１６に対して７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る脂質アシルトランスフェラーゼである。この酵素は、変種酵素とみなすことができる。]
[0267] 一態様において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）またはその変種（例えば、分子進化によって生じた変種）であり得る脂質アシルトランスフェラーゼである。]
[0268] 適切なＬＣＡＴは、当技術分野において公知であり、例えば、以下の生物体、哺乳動物、ラット、マウス、ニワトリ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａを含む植物、線虫、真菌、ならびに酵母の１つまたは複数から得ることができる。]
[0269] 一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、それぞれ、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４１２０４およびＮＣＩＭＢ ４１２０５として、２００３年１２月２２日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｍａｒｉｎｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）、２３ Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ Ｓｔｒｅｅｔ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＧＢにおいて特許手続きのための微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下、Ｌａｎｇｅｂｒｏｇａｄｅ １、ＤＫ−１００１ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ｋ、ＤｅｎｍａｒｋのＤａｎｉｓｃｏ Ａ／Ｓによって寄託されたｐＰｅｔ１２ａＡｈｙｄｒｏおよびｐＰｅｔ１２ａＡＳａｌｍｏを有するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＴＯＰ １０から獲得可能な、好ましくは獲得された脂質アシルトランスフェラーゼであり得る脂質アシルトランスフェラーゼである。]
[0270] 本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、リン脂質グリセロールアシルトランスフェラーゼであってもよい。リン脂質グリセロールアシルトランスフェラーゼとして、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ種、好ましくは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａもしくはＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、最も好ましくはＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａから単離されたもの、またはそれらの変種が挙げられる。]
[0271] 本発明に用いる最も好ましい脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１、３、４、１５、１６、３４、および３５によってコードされる。アシルトランスフェラーゼのシグナルペプチドがトランスフェラーゼの発現中に切断されていることが好ましいことを、当業者は認識しているであろう。配列番号１、３、４、１５、および１６のシグナルペプチドは、アミノ酸１〜１８位である。それゆえに、最も好ましい領域は、配列番号１および配列番号３（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）についてのアミノ酸１９〜３３５位、ならびに配列番号４、配列番号１５、および配列番号１６（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）についてのアミノ酸１９〜３３６位である。アミノ酸配列の相同性または同一性を決定するために用いる場合、本明細書に記載されているようなアラインメントは、成熟配列を用いることが好ましい。]
[0272] 一実施形態において、適切には、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１６に示されたアミノ酸配列を含み（またはアミノ酸配列からなり）、または配列番号１６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（またはアミノ酸配列からなる）。]
[0273] 一実施形態において、適切には、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号６８に示されたアミノ酸配列を含む（またはアミノ酸配列からなる）、または配列番号６８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（またはアミノ酸配列からなる）アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。]
[0274] したがって、相同性（同一性）を決定するための最も好ましい領域は、配列番号１および配列番号３（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）についてのアミノ酸１９〜３３５位、ならびに配列番号４、１５、および１６（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）についてのアミノ酸１９〜３３６位である。配列番号３４および３５は、さらなる翻訳後修飾を受ける場合もあるし、受けない場合もある、それぞれ、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａおよびＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ由来の脂質アシルトランスフェラーゼの成熟タンパク質配列である。]
[0275] 本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ、好ましくはＴ．ｆｕｓｃａからも単離することができる脂質アシルトランスフェラーゼであり得、最も好ましくは配列番号２８によってコードされたものである。]
[0276] 本発明に従って、および／または本発明の方法において用いる適切な脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列のいずれか一つを含み得、および／または以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る：
ａ）脂質アシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、かつ配列番号１６に示されたポリペプチド配列と、または配列番号６８に示されたポリペプチドと少なくとも７０％同一（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一）である核酸；
ｂ）配列番号１６もしくは配列番号６８に示されたアミノ酸配列、または配列番号１６もしくは配列番号６８と少なくとも７０％同一（好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一）であるアミノ酸配列を含む（またはアミノ酸配列からなる）（単離された）ポリペプチド；
ｃ）脂質アシルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、配列番号４９として示されたヌクレオチド配列、または配列番号４９として示されたヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一）であるヌクレオチド配列を含む（またはヌクレオチド配列からなる）核酸；
ｄ）配列番号４９として示されたヌクレオチド配列を含む核酸プローブに中程度または高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、かつ脂質アシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードする核酸；
ｅ）ａ）、ｃ）、またはｄ）に特定された核酸配列の断片である核酸；または
ｆ）ｂ）に特定されたポリペプチドの断片であるポリペプチド。]
[0277] 本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、好ましくはＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｓからも単離することができる脂質アシルトランスフェラーゼであり得、最も好ましくは、配列番号３２によってコードされたものである。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の本発明に用いる他の可能な酵素として、配列番号５、６、９、１０、１１、１２、１３、１４、３１、および３３によってコードされたものが挙げられる。]
[0278] 本発明に用いる酵素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、好ましくはＣ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓからも単離することができ、最も好ましくは、配列番号２９によってコードされたものである。]
[0279] 適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３７、３８、４０、４１、４３、４５、もしくは４７として示されたアミノ酸配列のいずれか一つ、またはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得、または配列番号３６、３９、４２、４４、４６、もしくは４８として示されたヌクレオチド配列のいずれか一つ、またはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。]
[0280] 一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、以下からなる群から選択される：
ａ）配列番号３６に示されたヌクレオチド配列を含む核酸；
ｂ）遺伝暗号の縮重によって配列番号のヌクレオチド配列に関連している核酸；および
ｃ）配列番号３６に示されたヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸。]
[0281] 一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３７に示されたアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。]
[0282] さらなる実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３７、３８、４０、４１、４３、４５、もしくは４７として示されたアミノ酸配列のいずれか一つ、またはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得、または配列番号３９、４２、４４、４６、もしくは４８として示されたヌクレオチド配列のいずれか一つ、またはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。]
[0283] さらなる実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３８、４０、４１、４５、もしくは４７として示されたアミノ酸配列のいずれか一つ、または本明細書に記載された使用のための、それらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。]
[0284] さらなる実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３８、４０、もしくは４７として示されたアミノ酸配列のいずれか一つ、または本明細書に記載された使用のための、それらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。]
[0285] より好ましくは一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４７として示されたアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。]
[0286] 別の実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４３もしくは４４として示されたアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。]
[0287] 別の実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４１として示されたアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。]
[0288] 一実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、以下からなる群から選択される核酸によってコードされ得る：
ａ）配列番号３６に示されたヌクレオチド配列を含む核酸；
ｂ）遺伝暗号の縮重によって配列番号３６のヌクレオチド配列に関連している核酸；および
ｃ）配列番号３６に示されたヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸。]

权利要求:

請求項1
ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）および脂質アシルトランスフェラーゼと混合する工程と、ｂ）約４５℃〜約９０℃で約１０分間と１８０分の間、前記混合物を撹拌する工程と、ｃ）油相とガム相を分離する工程とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムする方法。
請求項2
ｄ）最低約２時間と最高７日間の間、活性脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を含む前記ガム相をインキュベートする工程と、ｅ）前記ガム相から前記油を分離する工程とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
請求項3
（好ましくは、食用油の脱ガム、例えば、水脱ガムもしくは酵素的脱ガムまたはそれらの組合せから獲得可能である、または獲得された）ガム相を処理し（前記ガム相を、最低約２時間と最高７日間の間、単独の、または１つもしくは複数のホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素とインキュベートする）、前記ガム相から前記油を分離する方法。
請求項4
プロセスのｐＨが約ｐＨ５．０〜約ｐＨ１０．０の間である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
請求項5
前記脂質アシルトランスフェラーゼがＧＤＳｘモチーフおよび／またはＧＡＮＤＹモチーフを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
請求項6
前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である）を含む酵素として特徴付けられる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
請求項7
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属の１つまたは複数由来の生物から獲得可能であり得、好ましくは獲得され得る、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＣａｎｄｉｄａ。
請求項8
脂質アシルトランスフェラーゼが前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の生物から獲得可能であり、好ましくは獲得される、請求項７に記載の方法。
請求項9
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号４９、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、もしくは配列番号６３として示されるヌクレオチド配列、またはそれらと７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列のいずれか一つの発現によって獲得される、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
請求項10
請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法であって、ここで前記脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、以下：ａ）配列番号４９として示されたヌクレオチド配列、またはそれと７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１６に示されたポリペプチド配列または配列番号６８に示されたポリペプチド配列と少なくとも７０％同一である、核酸；ｃ）または配列番号４９として示された前記ヌクレオチド配列を含む核酸プローブと中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸の発現によって獲得されるポリペプチドである、方法。
請求項11
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにおけるヌクレオチド配列の発現によって獲得されるポリペプチドである、請求項１０に記載の方法。
請求項12
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８、配列番号１６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３５として示されるアミノ酸配列、またはそれらと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含む、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
請求項13
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８として示される前記アミノ酸配列、またはそれと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
請求項14
追加として、ホスホリパーゼＣが、油および／または水および／または脂質アシルトランスフェラーゼと混合される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
請求項15
水脱ガムプロセスの完了後の油相において油の収率を増加させるための食用油の水脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
請求項16
水脱ガムプロセスの完了後のガム相の粘性を減少させるための食用油の水脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
請求項17
水脱ガムプロセスの完了後の油相において油の収率を増加させるため、および／もしくはトリグリセリドレベルを増加させるため、ならびに／または水脱ガムプロセスの完了後の油相においてジグリセリドレベルを低下させるための食用油の水脱ガムにおけるホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
請求項18
未処理のガムと比較して、油の収率を増加させ、および／または向上したリンレベルを有する（酸性油の分離後の）固相を生じるための（食用油の脱ガム、例えば、水脱ガム、酵素的脱ガム、またはそれらの組合せから獲得可能であるか、または獲得された）ガム相のインキュベーションにおける（単独の、またはホスホリパーゼＣと組み合わせた）脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
請求項19
０．１〜４％ｗ／ｗの水が前記食用油と混合される、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
請求項20
酵素が、約４５℃〜約９０℃の範囲の温度で食用油に加えられる、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の使用。
請求項21
脱ガムプロセスのｐＨが約ｐＨ５．０〜約ｐＨ１０．０の間である、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の使用。
請求項22
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、約１０分間〜１８０分間、前記食用油と反応する、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の使用。
請求項23
前記脂質アシルトランスフェラーゼがＧＤＳｘモチーフおよび／またはＧＡＮＤＹモチーフを含む、請求項１５から２２のいずれか一項に記載の使用。
請求項24
前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である）を含む酵素として特徴付けられる、請求項１５から２３のいずれか一項に記載の使用。
請求項25
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属の１つまたは複数由来の生物から獲得可能であり、好ましくは獲得される、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の使用：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＣａｎｄｉｄａ。
請求項26
前記脂質アシルトランスフェラーゼが前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の生物から獲得可能であり、好ましくは獲得される、請求項２５に記載の使用。
請求項27
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号４９、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、もしくは配列番号６３として示されるヌクレオチド配列、またはそれらと７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列のいずれか一つの発現によって獲得される、請求項１５から２６のいずれか一項に記載の使用。
請求項28
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、ａ．配列番号４９として示されるヌクレオチド配列、もしくはそれと７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；ｂ．ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１６に示されるポリペプチド配列もしくは配列番号６８に示されるポリペプチド配列と少なくとも７０％同一である、核酸；またはｃ．配列番号４９として示されるヌクレオチド配列を含む核酸プローブと中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸の発現によって獲得されるポリペプチドである、請求項１５から２７のいずれか一項に記載の使用。
請求項29
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにおけるヌクレオチド配列の発現によって獲得されるポリペプチドである、請求項２８に記載の使用。
請求項30
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８、配列番号１６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３５として示されるアミノ酸配列、またはそれらと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含むポリペプチドである、請求項１５から２９のいずれか一項に記載の使用。
請求項31
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８として示されるアミノ酸配列、またはそれと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１５から３０のいずれか一項に記載の使用。
請求項32
前記脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる、請求項１５から３１のいずれか一項に記載の使用。
請求項33
実施例および図を参照して本明細書で一般的に定義された方法。
請求項34
実施例および図を参照して本明細書で一般的に定義された使用。